禽流感病毒的分子生物学研究进展

禽流感是一种主要感染禽类的烈性传染病,能引起巨大的经济损失。该病也能传染人,因此,对禽流感病毒的研究已成为一大热点。目前研究的重点主要集中在其病毒的分子生物学方面,以期能更有效地防制本病。文章从基因组及其编码的蛋白质、病毒毒力、毒力变异、基因疫苗和诊断技术等方面系统论述了禽流感病毒的分子生物学方面的研究进展,为进一步研制禽流感病毒基因工程疫苗及诊断制品,预防该病提供了理论基础。

羊传染性胸膜肺炎的病理学诊断

采用常规的病理学诊断方法,对一例羊传染性胸膜肺炎进行了确诊。结果发现该病例具有胸膜肺炎的典型病理变化,呈现纤维素性肺炎和淋巴细胞性间质肺炎,纤维素性物质的渗出和炎性细胞的浸润很明显,肺胸膜增厚,同时在肺间质还可见水肿、出血、血栓和淋巴栓的形成;另外心、肝、肾也均有不同程度的变性,淋巴结呈反应性增生。同时还检验出其病原为支原体。

H9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆及序列分析

从鸡胚尿囊液中提取H9N2亚型禽流感病毒的 RNA,根据已发表的 A型流感病毒(AIV)的核苷酸序列 ,设计一对特异引物 ,采用反转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR)成功地扩增了AIV的M基因.将M基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明所扩增的1 192 nt片段包含了完整的M基因的两个开放阅读框.核苷酸序列比较分析结果表明:该毒株与A/Hong Kong/1073/99(H9N2)、A/Duck/Hong Kong/380.5/2001(H5N1)、A/Duck/NY/191255-79/02(H5N2)相比 ,核苷酸序列的同源性在92.2 %～96.1 %之间,其相对应的氨基酸序列的同源性在91.7 %～96.3 %之间.

急性下呼吸道感染患儿中RSV的分离鉴定及分析

目的对2015年兰州单中心急性下呼吸道感染患儿中呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)进行分离鉴定及分析。方法收集临床急性下呼吸道感染患儿痰分泌物226份,在HEP-2细胞中连续盲传培养3代,收获的培养物用半巢式RT-PCR进行检测,选取强阳性样品进行测序以确定其型别,并对其流行病学特征进行分析。结果 226份样品中RSV阳性样本为76份(阳性率为34%)。RSV阳性患儿中,男女性别比为3∶1;年龄分布<6月龄患儿占45%,6月龄~2岁占35%,>2~5岁的占20%。冬季为发病高峰。76例RSV阳性患儿中,临床诊断依次为毛细支气管炎31例(40.79%)、喘息性支气管炎21例(27.36%)、支气管肺炎20例(26.32%)和支气管哮喘4例(5.26%)。40份强阳性RSV样品经测序确定为B亚型。结论 RSV是引起婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原之一,2015年RSV的流行株主要为B亚型。

人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性

目的将前期在大肠埃希杆菌中获得表达的A型人呼吸道合胞病毒兰州分离株截短的F1重组蛋白进行纯化和复性,为后期动物免疫制备抗原。方法 37℃诱导重组菌体p ET-42b-F1J/Rossata,诱导完毕后离心收集菌体,高压破碎菌体并收集包涵体后用不同浓度的Triton X-100(细胞裂解液)洗涤包涵体3次。洗涤的包涵体用8 mol/L尿素进行溶解并用镍离子亲和层析方法进行初步纯化,用阳离子交换层析方法对初步纯化蛋白进行最终的纯化。亲和层析纯化蛋白用3种不同的复性液进行了稀释复性。结果 37℃诱导5 000 m L重组菌p ET-42b-F1J/Rossata共收获37 g湿菌体,经过不同浓度Triton X-100洗涤包涵体后纯度可达75%。包涵体用8 mol/L尿素溶解后经镍离子亲和层析纯化纯度约为40%,再用阳离子交换层析介质SP HP进一步纯化样品后纯度可达90%。纯化蛋白以3种不同的复性液都能得到复性,其中复性液3的复性效果相对较好。结论实验中探索了人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的纯化方法及步骤,为后期的蛋白制备及动物免疫奠定了基础。

呼吸道合胞病毒融合蛋白F1和截短F1蛋白的表达差异研究

目的构建呼吸道合胞病毒融合蛋白F1和截短F1蛋白的原核表达载体,并对它们在大肠杆菌中的表达差异进行了初步研究。方法用DNAstar软件对呼吸道合胞病毒F1蛋白进行亲疏水性和抗原表位可能性分析后,将其两端的疏水区域截去之后与pET-42b(+)构建表达载体,同时用相同的表达系统构建F1蛋白的表达载体并将2种重组蛋白进行诱导表达。实验对2种蛋白在Rossata/pET-42b(+)菌株中的表达难易度、表达形式及初步洗涤的包涵体纯度进行了比较。结果与F1蛋白相比,截短的F1蛋白相对更容易表达,表达的可溶性蛋白含量更高,洗涤纯化后的包涵体纯度也更高。结论呼吸道合胞病毒F1蛋白截去两端疏水氨基酸后更容易表达,为后期蛋白的大量制备及其免疫原性研究奠定了基础。

采用半巢式RT-PCR检测兰州地区住院肺炎患儿下呼吸道分泌物中的RSV

从人呼吸道合胞病毒(hRSV)基因序列中高度保守的N基因处,设计了特异性半巢式引物,以反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法随机检测了46份兰州地区2007年春季住院肺炎患儿下呼吸道分泌物样本。结果46份样本中有19份扩增出了预期目的片段,对所有扩增产物进行基因序列测定。结果表明19份样本均有RSV感染,其检出率为41%,而且序列分析结果显示,所有RSV阳性样本均与RSVA亚型的同源性高于B亚型。

细胞工厂在轮状病毒基因重配株LD9培养中的应用初探

为了探索用细胞工厂代替转瓶培养轮状病毒基因重配株LD9及收获高滴度的LD9病毒原液和提高产量的可行性,分别在2层4、层细胞工厂和3L1、5L转瓶培养Vero细胞,比较两种容器内细胞的生长状态。结果显示,以相同活细胞数2.5×104/ml同时接种两种不同培养容器时,细胞工厂培养3d已长成单层,而转瓶培养需5d;对两种容器长满单层时的细胞经胰酶消化后通过细胞仪计数、分析,结果显示,两种容器培养细胞长成单层时的单位面积细胞密度相当;对长成致密单层细胞的两种容器以相同的MOI(MOI=0.1)接种LD9病毒,转瓶培养的病毒于第8d病毒滴度达到高峰,为6.0～6.5 lgCCID50/ml;细胞工厂第5d病毒滴度达高峰,为6.5 lgCCID50/ml,并于第9d病毒滴度再次达到峰值,为6.0～6.5 lgCCID50/ml,实现二次收获病毒。

轮状病毒四价灭活疫苗的制备及在小鼠的免疫原性研究

制备轮状病毒四价灭活疫苗,观察其在小鼠体内的抗体应答情况。实验采用轮状病毒原液经凝胶过滤层析纯化,灭活后配制四价疫苗,肌肉注射免疫小鼠,ELISA法测定小鼠血清IgA、IgG。将单价G1、G2、G3、G4型灭活病毒原液及四价轮状病毒灭活疫苗免疫小鼠后,均可刺激产生针对RV的高水平的特异性IgG抗体,但IgA应答较弱。表明四价轮状病毒灭活疫苗在小鼠中具备很好的免疫原性。

两种传代细胞系对轮状病毒D36株(P[4]G2)敏感性的比较

目的探讨轮状病毒D36株在MDCK细胞和Vero细胞上培养的适应性,确定其培养的最佳细胞基质及培养条件。方法将D36株以MOI 1.0按不同培养瓶分组接种MDCK细胞和Vero细胞,补充含有不同浓度胰酶的维持液,于不同时间观察两种细胞病变的情况,同时抽样检测病毒滴度,分析两种细胞对D36株的敏感性。结果D36株病毒感染MDCK细胞后第6天病毒滴度达到最高,为(5.00～5.50)lgCCID50/mL;而D36株病毒感染Vero细胞后病毒滴度于第8天达高峰,为(4.50～4.75)lgCCID50/mL。另外,在两种细胞维持液中加入约0.8μg/mL的胰酶均可提高病毒滴度。结论两种细胞系在同等条件下感染D36株病毒后,MDCK细胞比Vero细胞出现病变的时间早,每一批MDCK细胞培养物病毒滴度高于同批次试验的Vero细胞培养物。

实时逆转录PCR检测G1、G2和G4型轮状病毒方法的建立

目的建立3种用于检测G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因的一步法实时逆转录PCR,用于本实验室G1、G2和G4型轮状病毒的快速检测和定量、定性分析。方法设计G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针,采用G1、G2和G4型轮状病毒特异性体外转录RNAs,建立实时逆转录PCR,特异性检测G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因方法。结果 3种实时逆转录PCR标准曲线R^2均大于0.99,扩增效率均在90%～110%之间。不同浓度体外转录RNAs重复性检测结果 CV均<5%,且可以对单拷贝RNAs样本进行检测。结论本检测方法快速、灵敏且重复性好,可以对轮状病毒VP7基因进行特异而有效的检测,为实验室轮状病毒毒株的分型和定量检测提供了特异而有效的检测方法,也为今后多重实时逆转录PCR的建立奠定了试验基础。

人呼吸道合胞病毒兰州株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的构建用于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)体外拯救的RSV基因组全长cDNA克隆,并进行鉴定。方法根据RSV Long株基因组序列设计并合成引物,利用RT-PCR技术分6段扩增RSV LZ01/09基因组序列并构建克隆载体;测序后,利用重叠PCR与酶切连接技术,根据基因组序列选择特异性酶切位点,引入Kpn I、Xma I和Sal I酶切位点,构建成4个亚克隆载体;将亚克隆载体的插入片段连接至经过改造且包含T7启动子、锤头状核酶、多克隆位点、丁肝核酶、T7终止子的p RSV1载体中,构建RSV基因组全长cDNA克隆;对克隆全长cDNA序列进行测定,与亲本RSV LZ01/09基因组进行同源性比对分析,并与RSV实验参比株进行系统进化树分析。结果测序结果显示,RSV LZ 01/09的基因组全长为15 204 bp,与GenBank公布的RSV基因组序列长度相当,将完整的序列提交GenBank,登录号为KY782635;酶切及测序结果显示,用于RSV全长cDNA克隆构建的基本载体p BSKS-MCS(简称p RSV1)与预期相符,RSV全长基因组cDNA克隆质粒(简称转录载体p RSV1-4F)酶切片段大小与预期一致;同源性比对结果显示,全长cDNA序列与亲本RSV LZ01/09基因组序列同源性高达99.83%;系统进化树分析结果显示,其与RSV-A亚型序列同属于一个分支。结论测序及酶切分析结果表明已成功构建RSVLZ01/09基因组全长cDNA克隆,为建立拯救RSV重组病毒的反向遗传学系统平台奠定了基础。

呼吸道合胞病毒融合前F蛋白三聚体定量检测方法的建立及应用

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用。方法选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA。分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测。结果该方法确定的捕获抗体AM14包被浓度为1.25μg/mL,检测抗体D25浓度为0.50μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)。方法验证结果显示,线性范围为1.50~24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为87.41%~117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为5.47%~14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在87.65%~106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测。结论成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点。

呼吸道合胞病毒滴度双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)滴度。方法以RSV融合前F蛋白的两种抗体AM14与D25作为捕获抗体和检测抗体,通过对其抗体浓度的优化来确定DAS-ELISA较适反应条件,并对该方法的特异性、重复性、灵敏度及适用性进行验证。结果选择用AM14抗体作为捕获抗体,D25作为检测抗体。捕获抗体AM14较适工作浓度为20μg/mL,检测抗体D25的稀释比例为1∶3000。建立的DAS-ELISA与轮状病毒(rotavirus,RV)和人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3,HPIV-3)无交叉反应,且不同稀释倍数的RSV病毒进行批内与批间重复试验的变异系数(coefficient of variation,CV)均<10%;不同亚型的RSV及蛋白进行试验,均能检测到病毒滴度;检测结果与CCID50比较,可检测的稀释倍数略高。结论建立了检测RSV滴度的DAS-ELISA,该方法可为实验室RSV病毒滴度检测提供依据。

人呼吸道合胞病毒F1蛋白的原核表达及纯化

目的克隆A型人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州分离株F1基因,并进行原核表达和纯化。方法采用RT-PCR方法克隆RSV F1 ORF序列,克隆至pET-42b(+)表达载体,构建重组原核表达质粒pET-42b-F1,转化大肠杆菌Rossata(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用GST亲和层析树脂进行纯化。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约77 000,表达量约占菌体总蛋白的20%,以包涵体和可溶性两种形式存在;该蛋白可与鼠抗人RSV单抗发生特异性反应,纯化后纯度约为50%。结论已原核表达并纯化了HRSV F1蛋白,为其血清抗体的制备及免疫原性研究奠定了基础。

呼吸道合胞病毒减毒活疫苗研制进展

人呼吸道合胞病毒（resipiratory syncytial virus，RSV）是世界范围内儿童下呼吸道感染的主要病原体，但其疫苗的开发面临许多困难和挑战。随着反向遗传学及相关技术和工具的应用，RSV疫苗，尤其是减毒活疫苗的研制已经取得很大进展。此文就RSV减毒活疫苗研发的主要突破和研究进展进行综述。

人呼吸道合胞病毒黏附蛋白片段的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株黏附蛋白(G)片段。方法利用PCR技术从HRSV兰州株(A亚型)中扩增G基因AA75-225片段,克隆至原核表达载体pET-42b(+)中,构建重组表达质粒pET-42b-G,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 PCR扩增获得453 bp的DNA片段;重组表达质粒pET-42b-G经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量为50 230,表达量占菌体总蛋白的25%,以包涵体和可溶性两种方式存在;纯化后重组蛋白纯度可达95%以上,可与抗RSV-G蛋白单克隆抗体特异性结合。结论已成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了HRSV兰州株G片段,为后续RSV疫苗的研制、RSV感染的血清学诊断及试剂盒的研发提供了材料。

线性化聚乙烯亚胺介导的高效瞬时转染条件的优化

目的优化线性化聚乙烯亚胺(polyethylenimine linear,PEI)介导的高效瞬时转染条件,提高重组蛋白在人胚胎肾(human embryonic kidney,HEK)293F悬浮细胞中的瞬时表达效率.方法构建和鉴定重组质粒增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)/pcDNA3.1+,通过瞬时转染的方式将质粒转入HEK293F细胞中进行表达.对转染试剂PEI与重组质粒的比例以及收获时间进行优化,通过倒置显微镜观察、SDS-PAGE和流式细胞仪检测目标蛋白的表达量,确定目标蛋白在HEK293F细胞中的最佳表达条件.采用优化后的条件在T500摇瓶(工作体积120 ml)中进行扩大表达.结果构建的重组质粒EGFP/pcDNA3.1+序列正确,在重组质粒浓度为3.0μg/ml、DNA∶PEI为2∶1、转染后24 h添加终浓度为2 mmol/L的丙戊酸钠、转染后4 d收获条件下,目的蛋白的表达量最高.此条件也适用于放大培养体积至T500的瞬时转染.结论优化了一种快速有效的基于PEI的瞬时转染方法来高水平表达重组蛋白.

2018年甘肃省10岁以下儿童流感病毒和呼吸道合胞病毒感染特征

目的为了解甘肃省2018年10岁以下儿童中门诊流感样(influenza-like illnes,ILI)病例中流感病毒(influenza virus,Flu)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的病原学特点及流行特征,为Flu、RSV疾病的诊断治疗及防控提供依据。方法选取甘肃省19家国家级流感监测哨点医院ILI病例咽拭子标本共8559份,用实时荧光PCR检测流感病毒,对其中的3436份,用RT-PCR法对RSV检测。结果Flu阳性934份,阳性率10.91%,其中甲型H1N1阳性431例、H3N2阳性70例、乙型428例、甲型H1N1和乙型混合5例;RSV阳性320份,阳性率9.31%。14个市州之间Flu、RSV检测阳性率差异存在统计学意义(χ^2=56.99,Р<0.01;χ^2=263.34,Р<0.01)。流感1月份为最高峰,阳性率为50.70%,乙型B/Yamagata系(占53.53%)和甲型H1N1(占39.93%)同时流行。RSV的流行高峰在2~4月,阳性率达13.98%,5岁以下儿童RSV阳性率10.11%,高于5岁及以上儿童RSV的阳性率6.94%.具有统计学意义(χ^2=7.67,Р<0.01)。结论10岁以下儿童ILI就诊病例中RSV和Flu是主要的病原,每年冬春季节存在流行高峰,建议加强RSV的监测。

呼吸道合胞病毒TaqMan~实时定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的TaqMan~实时定量RT-PCR检测方法。方法根据GenBank中RSV相关序列,以A、B亚型毒株基因组保守区域设计并合成RSV特异性引物和探针,采用体外转录RNA标准品,建立TaqMan~实时定量RT-PCR方法,同时验证方法特异性、检测范围、灵敏度和精密度。采用建立的方法检测50份下呼吸道感染患儿的痰样品。结果 RNA标准品建立的标准曲线R2> 0. 99,扩增效率在90%～110%之间。建立的方法可特异性扩增RSV Long株和RSV A2株核酸样本,IFA和HPIV-3核酸样本均无扩增;最高可检测到1. 3×10~9 copies/μL的RNA标准品,最低可检测到单拷贝的RNA标准品;4名实验员检测同一样品Ct值的试验内CV小于1. 72%,试验间的CV在2. 44%～3. 39%之间。50份下呼吸道感染患儿痰样品中,24份为RSV阳性,阳性率为48%。结论成功建立了RSV的TaqMan~实时定量RT-PCR方法,且该方法快速、特异、灵敏,可用于临床样本中RSV的有效检测。