HCV患者外周血单个核细胞蛋白质表达质谱分析

目的:应用比较蛋白质组学的方法分析丙型肝炎患者外周血单个核细胞蛋白质表达模式的变化及寻找丙型肝炎相关生物标记分子,进一步识别鉴定其差异表达蛋白质,分析其对丙型肝炎慢性化机制的意义。方法:应用固相化pH梯度双向凝胶电泳(2-DE)分离健康者(10)及HCV患者(28)PBMC的总蛋白质,凝胶银染显色后,PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质指纹图谱,通过SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果:得到两张2-DE图谱,HCV患者及健康者PBMC凝胶的蛋白质点数分别为625及614;初步筛选出HCV患者与健康者存在明显差异的12个蛋白点,经质谱分析,初步鉴定了10种蛋白质。这些差异蛋白质包括病毒蛋白、蛋白质合成与分解、三大代谢相关酶类、细胞结构相关蛋白质以及信号转导相关蛋白质。结论:应用2-DE及MALDI-TOF-MS方法建立了HCV患者PBMC双向凝胶电泳图谱,分离并初步鉴定了10种与HCV感染相关的差异表达的蛋白质,为研究HCV慢性化相关机制提供新的线索。

HCV-F基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响

探讨丙型肝炎病毒(HCV)F基因对PI3K表达的影响。应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得HCV-F基因片段,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0(-)中。通过酶切、PCR及测序鉴定,HCV-F基因已正确插入到pcDNA3.0(-)中,再利用脂质体转染HepG2细胞。经RT-PCR及Westernblot检测,HCV的F基因在HepG2细胞中获得表达,而且在表达重组HCV-F的转染HepG2细胞中,检测到PI3K蛋白的表达。实验表明HCV-F可在体外激活PI3K及其信号通路。

丙型肝炎病毒F蛋白上调肝癌细胞HepG_2中Bcl-2和Bax表达

目的研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因1b型F蛋白对HepG2细胞中Bcl-2、Bax表达的影响。方法应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增HCV 1b型的F基因,构建pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C真核表达载体,分别将pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C、pEGFP-C3(阴性对照)瞬时转染HepG2细胞,48h后抽细胞总蛋白质,蛋白质印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax表达的变化。结果转染F基因的HepG2中Bcl-2表达水平略高于未转染的细胞,但Bax表达水平显著高于未转染的细胞。结论 HCV F蛋白具有调节原癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax的特性,可能与肝癌的形成有关。

HCV-F蛋白的原核表达以及对Th1/Th2型细胞因子的影响

目的探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)1b型F蛋白对Th1/Th2型细胞因子的影响。方法收集慢性HCV患者(chronic hepatitis patient,CHP)和HCV肝癌患者(hepatocellular carcinoma patient,HCCP)的血样,检测F抗体(F antibody,F-Ab)的阳性率并且分成4组,F-Ab(+)CHP、F-Ab(-)CHP、F-Ab(+)HCCP、F-Ab(-)HCCP;分离患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用F蛋白刺激,72 h后用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测细胞上清干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)和白介素5(in-terluekin-5,IL-5)水平。结果 F-Ab(-)CHP组IFN-γ高于F-Ab(+)CHP组(P=0.020);F-Ab(-)HCCP组IFN-γ高于F-Ab(+)HCCP组(P=0.019),F-Ab(+)HCCP组IL-5的水平高于F-Ab(-)HCCP组(P=0.032);F-Ab(+)CHP组IL-5的水平高于F-Ab(-)CHP组(P=0.041)。结论在体外培养的PBMC中,F蛋白有上调IL-5水平和下调IFN-γ水平的作用,提示可能与肝炎慢性化和肝癌的发生机制有关。

丙型肝炎病毒感染者F基因区变异临床意义的初步研究

目的探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)F基因区变异的临床意义。方法以78例未治疗慢性丙型肝炎患者为研究对象,采用单链构象多态性分析对HCV-F基因区进行准种分析,实时荧光定量聚合酶链反应对HCV RNA进行定量检测,利用酶联免疫吸附试验分别对患者血清中的抗F蛋白抗体、Th1(IL-12,IFN-γ)和Th2(IL-5,IL-10)细胞因子水平进行检测分析。结果 78例慢性丙型肝炎患者中有46例为抗HCV-F抗体阳性,阳性率为59%。HCV1b亚型患者F基因区准种数目高于非HCV1b亚型(P=0.002)。F基因区SSCP条带数与HCV RNA载量及ALT/AST水平呈正相关(均有P<0.05)。另外,与F基因准种数量≤2的患者相比,F基因准种数量>2的患者血清中,Th1细胞因子IL-12、IFN-γ水平降低(P=0.023,P=0.010),Th2细胞因子IL-5、IL-10水平显著升高(P=0.024,P=0.012)。结论 HCV-F基因区准种多样性与病毒复制、肝损伤和机体Th2优势应答有关,具有一定的临床意义。

丙肝病毒F基因对c-myc转录调控作用

目的观察丙型肝炎病毒（HCV）F基因对c-myc启动子转录活性的影响,探讨HCV F基因表达产物参与肝细胞癌变的机制。方法构建c-myc启动子的萤光素酶报告质粒,与HCV-F和HCV-C的表达质粒共转染人肝癌细胞系HepG 2细胞,测定萤光素酶的活性,分析HCV-F、HCV-C对c-myc启动子转录活性的影响。结果在HepG 2细胞中,HCV-C对c-myc启动子的转录具有明显的促进作用,启动子的转录活性比对照组提高约7倍,且在HCV-C的剂量为2~10μg时,其作用具有剂量依赖性;HCV-F对c-myc启动子转录活性也具有激活作用,在剂量为2μg时,启动子的转录活性约为对照组的3倍,c-myc启动子对HCV-F的剂量依赖激活作用不明显。结论 HCV-F相比HCV-C不能有效的调节c-myc启动子转录活性,HCV-C起主要的调节功能。