凝血因子Xα抑制剂对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响

目的探究凝血因子Xα(FXα)抑制剂利伐沙班对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响及相关机制。方法将C57BL/6小鼠随机分为对照组(PBS组)、标准饲料组(N-LPS组)、0.2 mg/g利伐沙班组(L-LPS组)和0.4 mg/g利伐沙班组(H-LPS组)。PBS组气管内滴入磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照,标准饲料喂养;N-LPS组、L-LPS组和H-LPS组用气管内滴注内毒素方法建立小鼠急性肺损伤模型,造模前分别给予标准饲料或含有0.2 mg/g和0.4 mg/g利伐沙班的饲料喂养10 d,测定血药浓度。通过检测肺组织学病理评分、小动物CT、肺水肿、炎症细胞浸润以及支气管肺泡灌洗液中炎症细胞因子激活等评价肺损伤程度。用Western blot及免疫组织化学方法检测髓过氧化物酶、蛋白酶激活受体-2(PAR-2)和核转录因子-κB(NF-κB)表达情况。结果应用含有利伐沙班药物饲料喂养的小鼠血浆中利伐沙班血药浓度增加,凝血酶原时间延长。利伐沙班干预可以减轻内毒素诱导小鼠急性肺损伤白细胞浸润和肺组织结构的病理改变(P<0.05)。药物干预组与急性肺损伤组相比,肺泡灌洗液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、总蛋白和伊文思蓝浓度降低。内毒素诱导的急性肺损伤肺组织中PAR-2和NF-κB蛋白表达增加,利伐沙班干预可以减轻急性肺损伤病理改变,降低PAR-2和促炎细胞因子表达,降低肺损伤伤后肺组织中P65蛋白的磷酸化水平。结论利伐沙班可通过非凝血途径,经抑制PAR-2-NF-κB信号通路来缓解内毒素诱导急性肺损伤的炎症反应。

利伐沙班对内毒素干扰人脐静脉内皮细胞损伤的影响

目的探讨凝血因子Ⅹa(FⅩa)抑制剂利伐沙班对内毒素诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的作用及其机制。方法体外培养HUVEC,待细胞生长至80%融合时,按随机数字表法分为4组:空白对照组(DMEM培养基)、脂多糖(LPS)组(100μg/LLPS培养16h)、FⅩa+LPS组(100nmol/LFⅩa预处理24h后加入LPS)、FⅩa+RIV+LPS组(100nmol/LFⅩa+1μmol/L利伐沙班预处理24h后加入LPS)。各组细胞处理后用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性,用细胞划痕实验检测细胞迁移能力,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用Transwell小室法及伊文思蓝检测单层内皮细胞屏障通透性,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-1β、IL-6)水平,用蛋白质免疫印迹试验(WesternBlot)检测细胞核转录因子-?κB(NF-κB)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)炎症信号通路关键蛋白的表达。结果与空白对照组比较,LPS组细胞活性降低,细胞迁移能力增加,凋亡细胞增多,单层内皮细胞屏障通透性增加,TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子分泌增加,炎症信号通路关键蛋白磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、磷酸化转化生长因子激酶1(p-TAK1)和磷酸化NF-κBp65(p-NF-κBp65)表达增加,说明LPS可以刺激血管内皮细胞的炎症反应,从而对细胞活性、凋亡及功能有明显影响。FⅩa+LPS组除IL-6水平显著高于LPS组外,其他指标与LPS组比较差异均无统计学意义。与FⅩa+LPS组比较,FⅩa+RIV+LPS组细胞活性明显提高(A值:0.42±0.02比0.33±0.02),细胞迁移能力明显下降(倍:1.78±0.17比2.24±0.20),凋亡细胞明显减少〔(11.30±0.70)%比(21.03±0.19)%〕,单层内皮细胞通透性明显降低〔(149±12)%比(253±15)%〕,炎性因子水平明显降低〔IL-1β(ng/L):163.2±20.7比477.8±20.2,IL-6(ng/L):69.3±0.5比238.0±24.1,TNF-α(ng/L):117.0±13.1比196.2±4.5),炎症信号通路中p-TAK1和p-NF-κBp65蛋白表达水平明显降低(p-TAK1/TAK1:0.74±0.09比1.85±0.15,p-NF-κBp65/NF-κBp65:1.15±0.17比2.36±0.20),差异均有统计学意义(均P<0.05);而p-JNK和p-p38MAPK蛋白表达水平差异无统计学意义(p-JNK/JNK:1.64±0.12比1.65±0.15,p-p38MAPK/p38MAPK:2.31±0.32比2.35±0.20,均P>0.05)。结论利伐沙班可以有效缓解内毒素刺激HUVEC的炎症反应,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路激活而非MAPK信号通路有关。