shRNA沉默eIF4E基因表达对人喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的构建靶向真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)的shRNA表达载体,观察eIF4E表达抑制对喉癌细胞生物学行为的影响。方法根据人eIF4E mRNA序列设计并构建2个靶向人eIF4E基因的shRNA真核表达载体(pSilencer4.1-s1和pSilencer4.1-s2);然后以脂质体转染的方法将shRNA表达质粒转染至人喉癌细胞系Hep-2,经G418筛选出稳定转染的阳性细胞。分别通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting技术对构建成功的2个shRNA干扰质粒进行有效性筛选,分析其eIF4EmRNA及蛋白表达水平,并筛选出表达抑制最强的稳定转染喉癌细胞系(Hep-2-s2)。通过噻唑蓝(MTT)试验检测Hep-2-s2细胞的体外增殖活性,流式细胞仪技术(FCM)检测其细胞周期和凋亡变化情况。结果经双酶切证实转录shRNA的目的基因片段已成功克隆入pSilencer4.1-CMVneo真核表达载体中,经测序证明插入序列完全正确;eIF4E-shRNA2可以显著下调eIF4E mRNA及蛋白表达水平;eIF4E基因的表达下调明显抑制Hep-2细胞的体外增殖(P<0.05);Hep-2-s2细胞的G0/G1期细胞比例显著增加了(14.7±1.1)%,而S期细胞比例减少了(13.2±1.6)%(P<0.05);Hep-2-s2的细胞凋亡率显著增加到(18.3±1.7)%(P<0.05)。结论shRNA介导的eIF4E基因表达下调可显著降低喉癌细胞的增殖活性,同时诱导其细胞周期阻滞和凋亡率增加,为喉癌基因治疗筛选出了新的靶点。