弓形虫Ⅱ型ROP16蛋白对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383炎性反应的影响

目的探讨弓形虫Ⅱ型ROP16蛋白对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383炎性反应的影响。方法实验设置空白对照组(正常NR8383细胞)、空载组(pHBLV-CMV)和ROP16过表达组(pHBLV-CMV ROP16),构建ROP16过表达慢病毒载体并转染至NR8383细胞中,经筛选得到稳转细胞系,利用RT-PCR和Western blot法验证慢病毒在ROP16过表达组是否转染成功;免疫荧光法确定ROP16蛋白在NR8383细胞中的定位;Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、核转录因子κB(NF-κB)、磷酸化核转录因子κB(P-NF-κB)、信号转导与转录激活因子1(STAT1)及磷酸化转录活化蛋白1(P-STAT1)蛋白的表达情况;RT-PCR检测iNOS、Arg-1及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-10 mRNA水平的表达情况;ELISA检测培养上清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-10的含量。结果ROP16过表达慢病毒成功稳转NR8383细胞,镜下可观察到明显绿色荧光;免疫荧光结果显示,ROP16蛋白定位于NR8383细胞核中;Western blot结果显示,ROP16过表达组中M1型巨噬细胞表面标志蛋白iNOS的表达高于空白对照组,其通路蛋白NF-κB、P-NF-κB、STAT1、P-STAT1的表达均高于空白对照组(P均<0.05),而M2型巨噬细胞表面标志蛋白Arg-1表达低于空白对照组(P<0.05);RT-PCR结果显示,ROP16过表达组iNOS及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA均升高(P均<0.01),而Arg-1及抗炎因子TGF-β、IL-10 mRNA均下降(P均<0.05);ELISA结果显示,过表达组中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-12含量均高于空白对照组(P均<0.05),而抗炎因子TGF-β和IL-10的表达均低于空白对照组(P均<0.05)。结论弓形虫Ⅱ型ROP16定位于NR8383巨噬细胞核中并稳定表达,同时向M1型巨噬细胞方向极化,引发促炎反应。

弓形虫ROP16蛋白在人白血病细胞THP-1表达及对其细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨弓形虫Ⅱ型(Me49)ROP16蛋白在急性单核细胞白血病细胞株THP-1中的表达及其对THP-1细胞增殖与凋亡的影响。方法构建过表达ROP16(overExp-ROP16)和空载体(overExp-NC)慢病毒,通过转染THP-1细胞,72 h后观察荧光表达情况,采用PCR与Western blot验证ROP16在THP-1细胞中的表达。免疫荧光技术检测ROP16蛋白在THP-1细胞中的定位。CCK-8与流式细胞术检测细胞增殖及凋亡。采用qRT-PCR检测细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相对表达水平。Western blot检测Bax、Bcl-2、Pro-Caspase-3和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达变化。结果构建的过表达ROP16重组慢病毒转染到THP-1细胞后,可观察强荧光信号,ROP16蛋白在THP-1细胞中成功表达。免疫荧光结果表明ROP16蛋白定位于THP-1细胞核。CCK-8与流式细胞术证实ROP16蛋白抑制THP-1细胞的增殖并促进其凋亡(均P<0.05)。与对照组相比,过表达组促凋亡因子Bax、Caspase-3 mRNA高表达(P<0.05),抗凋亡因子Bcl-2 mRNA低表达(P<0.01),Bax与Cleaved-Caspase-3蛋白水平上调(P<0.01),Bcl-2与Pro-Caspase-3蛋白水平下调(P<0.01)。结论构建的慢病毒表达质粒overExp-ROP16可在急性单核细胞白血病细胞株THP-1中表达且通过入核调节凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3而抑制THP-1细胞增殖,促进其凋亡。

可见光通信混合调制接收机的实验设计

利用非对称裁剪直流偏置光正交频分复用(ADO-OFDM)调制分支信号的时域反对称和周期特性,结合快速傅里叶变换算法,在时域上实现了既有混合调制接收机的低复杂度设计.通过理论分析和仿真实验相结合的教学手段,向学生更好地展示了光通信技术的完整解调过程,使学生更深入地理解现代信号处理和通信技术的应用,实现了教学和科研的有机结合.

肺炎克雷伯菌铁载体含量对耐碳青霉烯类抗生素的影响

目的探究肺炎克雷伯菌铁载体含量与耐碳青霉烯类抗生素的关系。方法采用铬天青S(CAS)检测法确定肺炎克雷伯菌是否产铁,紫外分光光度法检测铁载体的相对含量,根据中位数将60株临床分离菌分为高产铁载体组(30株)和低产铁载体组(30株);用聚合酶链式反应(PCR)检测铁载体基因和碳青霉烯类耐药基因;采用改良碳青霉烯类失活法(mCIM)实验对碳青霉烯酶的型别进行初步分类。分析肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药与其铁载体含量的关系。结果60株肺炎克雷伯菌均产生铁载体,低产铁载体组的铁载体含量低于高产铁载体组(t=9.530,P<0.01);PCR法共检出27株碳青霉烯耐药基因阳性菌,mCIM试验的敏感度与特异度分别为92.59%和90.90%。高产铁载体组耐药率低于低产铁载体组(χ^(2)=9.600,P<0.01)。根据药敏结果将60株受试菌分耐药组和敏感组各30株,碳青霉烯类药物敏感组菌株较耐药组菌株铁载体产量更高(t=2.481,P<0.05)。结论肺炎克雷伯菌铁载体的产量与碳青霉烯类抗生素耐药性有关。

弓形虫ROP16蛋白与NKRF互作对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡和周期的影响

为探讨刚地弓形虫Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型ROP16蛋白与NKRF互作对A549细胞凋亡、周期及增殖的影响。本研究通过构建过表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16蛋白和空载体对照组的慢病毒感染A549细胞,并通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western-blot对Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型ROP16的表达进行验证。利用免疫共沉淀与液相色谱-质谱联用技术获取同ROP16可能发生互作的蛋白,并利用Venn图、Score分值、Intensity分值筛选出评分较高的互作蛋白NKRF进行验证。设计并合成NKRF-siRNA,分别转染至过表达Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型ROP16细胞,并利用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,利用RT-qPCR和Western-blot分别对凋亡相关蛋白及细胞周期相关蛋白的m RNA和蛋白表达水平进行检测。此次试验成功构建了Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型ROP16过表达A549稳转细胞株。利用IP-MS及CO-IP技术筛选并验证ROP16互作蛋白NKRF。筛选并构建NKRF沉默的过表达各型ROP16蛋白A549细胞。在过表达Ⅰ型、Ⅲ型ROP16的A549细胞中,促凋亡蛋白Bax表达水平上调,抑凋亡蛋白BCL-2、Caspase-9、p53表达水平明显下调;细胞周期抑制蛋白p21表达明显上调,而G1/S期相关蛋白CDK6和CyclinD1蛋白表达明显下调,提示Ⅰ、Ⅲ型ROP16蛋白会引起细胞凋亡和周期停滞,而在沉默NKRF组中,过表达Ⅰ型、Ⅲ型ROP16蛋白的A549细胞中Ⅰ型、Ⅲ型ROP16蛋白的促凋亡作用减弱,细胞周期无明显停滞,与Ⅱ型ROP16蛋白之间没有统计学差异。综上所述得出弓形虫Ⅰ、Ⅲ型ROP16蛋白通过与NKRF互作,诱导A549细胞凋亡、细胞周期阻滞并抑制A549细胞增殖。

刚地弓形虫CDPK1蛋白结构与抗原表位的生物信息学分析

目的对刚地弓形虫钙依赖性蛋白激酶1(Toxoplasma gondii Calcium-dependent protein kinases1,TgCDPK1)的蛋白结构及抗原表位进行分析,为弓形虫病疫苗的研制提供参考依据。方法在NCBI数据库中检索TgCDPK1蛋白的氨基酸序列,分别采用ProtParam、ProtScale、MotifyScan、TMHMM 2.0、SMART、SOPMA、Phyre2、IEDB、PSORT、STRING、PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES及SYFPEITHI在线分析网站预测TgCDPK1蛋白的氨基酸组成、理化性质、蛋白翻译后修饰位点、结构域、功能域、二级结构、三级结构、互作蛋白、抗原决定簇、B细胞抗原表位及T细胞抗原表位等。结果TgCDPK1蛋白由582个氨基酸组成,其分子式是C_(2898)H_(4573)N_(785)O_(888)S_(25),分子质量单位(Mr)为65.42142×10^(3),理论等电点为6.04,不稳定指数为36.980,脂溶性指数为79.91;该蛋白存在36个蛋白翻译后修饰位点;不含跨膜结构域,但含4个EF-手钙结合域及1个蛋白激酶结构域;蛋白二级结构中52.96%为α-螺旋,14.00%为延长链,7.90%为β-转角,35.05%为无规则卷曲;共含24个抗原决定簇,平均抗原倾向指数为1.0237;TgCDPK1蛋白抗原表位分布广泛,含有8个B细胞抗原表位、14个CTL细胞表位和12个Th细胞表位。结论TgCDPK1蛋白含有多种抗原表位,免疫原性高,可作为弓形虫病疫苗研制的候选蛋白。

刚地弓形虫ME49虫株ROP16蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学方法分析弓形虫ME49虫株ROP16蛋白(ME49-ROP16)的理化性质、结构特点等,并预测其潜在的B、T细胞抗原表位及其互作蛋白,为弓形虫疫苗的研究提供理论基础。方法登录NCBI数据库下载ME49虫株ROP16蛋白的氨基酸序列,利用在线软件ProtParam预测ROP16蛋白的理化性质;使用ProScale预测ROP16蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性及β-折叠;采用SignalP-4.1预测ROP16蛋白的信号肽;运用TMHMM-2.0预测ROP16蛋白的跨膜结构;利用SOMPA和Phyre2预测ROP16蛋白的二、三级结构;通过Netphos3.1、NetNGlyc1.0、YinOYang-1.2预测ROP16蛋白的磷酸化位点、N-糖基化位点和O-糖基化位点;运用Predicting Antigenic Peptides预测ROP16蛋白的抗原决定簇;使用IEDB预测ROP16蛋白的优势B细胞表位;运用SYFPEITHI预测ROP16蛋白的T细胞优势表位;采用STRING预测软件分析与其相互作用的蛋白。结果ME49-ROP16蛋白由707个氨基酸组成,分子式为C_(3338)H_(5350)N_(966)O_(1033)S_(21),相对分子质量76.21631×10^(3),其理论等电点是8.97,不稳定系数为59.30,为不稳定蛋白;脂溶性指数为79.25,总的平均亲水性为-0.320,为亲水性蛋白;其二级结构中α-螺旋占35.64%,延伸链占10.75%,β-转角占5.94%,无规卷曲占47.67%;该蛋白含有83个氨基酸磷酸化位点,14个N-糖基化位点,无O-糖基化位点。ME49-ROP16蛋白具有信号肽序列,无跨膜结构;其平均抗原倾向指数为1.0340,共有25个抗原决定簇区域,有7条B细胞优势表位,14条CTL细胞优势表位,14条Th细胞优势表位,与ACC1、ACC2、PKG、ROP18为互作蛋白。结论生物信息学分析ME49-ROP16蛋白为不稳定亲水性蛋白,含有多个B、T细胞优势表位,并与ACC1、ACC2、PKG、ROP18为互作蛋白,为以该蛋白为靶点的弓形虫疫苗研制奠定了基础。

过表达碳青霉烯酶OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体信号通路的影响

目的探讨过表达OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路的影响。方法将重组质粒pET32a(+)-OXA-48转化至E.coli BL21(DE3)中,获得的重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)进行菌落PCR及测序鉴定。以A_(600)(0.3、0.5、0.7)、IPTG终浓度(0.4、0.6、0.8 mmol/L)及诱导时间(2、4、6 h)为变量,mRNA转录水平为响应值,设计3因素3水平正交试验,优化质粒的诱导表达条件。纸片扩散法检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对亚胺培南(Imipenem,IPM)、美罗培南(Meropenem,MEM)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、头孢吡肟(Cefepime,FEP)的耐药性;通过生物膜形成试验和血清抵抗力试验检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)的适应性。将pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)、pET32a(+)-BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)菌株分别感染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,qRT-PCR法检测细胞中TLR2、TLR4和NF-кB(p65)基因mRNA转录水平,ELISA法检测细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达情况。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)构建正确。最佳诱导条件:A_(600)为0.3,IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为2 h。与pET32a(+)-BL21(DE3)菌株比较,重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对IPM、MEM、CRO和FEP 4种抗生素的耐药性明显降低(t=7.14~22.32,P均<0.05),形成的生物膜明显增多(t=15.69,P<0.05),在血清中的存活率显著升高(P<0.05);pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞24 h后,TLR2基因mRNA转录水平显著增加(t=5.77,P<0.05),感染12及24 h后,TLR4、NF-кB(p65)基因mRNA转录水平显著增加(t=3.71~10.06,P<0.05)。与正常细胞组相比较,pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞6、12和24 h后,IL-6及TNF-α的表达水平显著升高(t分别为7.90~13.44及5.40~6.32,P均<0.01),IL-10表达水平显著下降(t=3.15~4.08,P均<0.05),TGF-β的表达水平差异无统计学意义(t=0.013~1.41,P均>0.05);感染12和24 h时,IL-6表达水平显著高于pET32a(+)-BL21(DE3)组(t分别为2.92和3.79,P均<0.05)。结论过表达OXA-48可降低细菌的耐药性,提高适应性及宿主细胞TLRs信号通路相关因子的转录水平,还可影响宿主细胞下游细胞因子的表达水平。

弓形虫VEG株ROP16蛋白对THP-1细胞免疫调节及机制研究

为了探究弓形虫VEG株ROP16蛋白在THP-1细胞中的表达及对其免疫反应的影响和相关机制,本研究利用慢病毒构建过表达ROP16(overEep-ROP16)载体,空载体(overEep-NC)为对照,通过转染THP-1细胞构建稳转细胞株,对其荧光蛋白表达情况、ROP16在THP-1细胞中的表达及定位进行检测;通过RT-PCR检测炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-10、IL-12 mRNA相对表达水平;Western-blot方法检测炎性小体NLRP3、Caspase-1蛋白与信号通路蛋白STAT3、pTyr705-STAT3的表达水平。结果显示,构建的过表达ROP16重组慢病毒转染THP-1细胞后可观察到强绿色荧光,在THP-1细胞中rop16基因在mRNA与蛋白水平均成功表达且该蛋白定位于THP-1细胞核;与对照组相比,过表达组促炎细胞因子IL-1β、IL-18、TNF-αmRNA表达水平上调(P<0.01),而IL-12 mRNA下调(P<0.01),抗炎细胞因子IL-10 mRNA上调(P<0.01),炎性小体NLRP3、Caspase-1蛋白与信号通路蛋白pTyr705-STAT3相对表达量上调(P<0.01),STAT3无显著变化(P>0.05)。上述结果表明,构建的过表达ROP16重组慢病毒稳转染至THP-1细胞内并表达蛋白,表达的蛋白定位于THP-1细胞核内,该蛋白能激活NLRP3炎性小体促发炎症的发生并通过磷酸化STAT3 Tyr705调控抗炎作用。

弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白对THP-1细胞炎性反应的影响及其机制研究

目的探究弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白对THP-1细胞炎性反应的影响及相关机制。方法构建过表达ROP16(pHBLV-CMV ROP16)和空载体(pHBLV-CMV)慢病毒,转染THP-1细胞,建立稳定过表达ROP16细胞组、空载体及未转染的空白对照,转染72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况,采用RT-PCR与Western blot检测ROP16 mRNA及蛋白在THP-1细胞中的表达,验证转染情况;稳转细胞采用RT-PCR检测炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)mRNA表达水平;通过免疫荧光法检测ROP16蛋白在THP-1细胞中的定位;采用Western blot检测THP-1细胞中炎性小体NLRP3、Caspase-1蛋白的表达水平。结果构建的过表达ROP16重组慢病毒成功稳转THP-1细胞,可观察到表达的绿色荧光蛋白;免疫荧光法检测ROP16蛋白定位于THP-1细胞核;pHBLV-CMV ROP16过表达慢病毒载体转染THP-1细胞后ROP16mRNA表达水平较未转染组上调(t=43.63,P<0.01),促炎细胞因子IL-1β、IL-18及炎性小体NLRP3 mRNA表达水平上调(t值分别为12.91、25.61、30.26,均P<0.05),而IL-12 mRNA下调(t=42.35,P<0.01),抗炎细胞因子IL-10 mRNA上调(t=91.39,P<0.05);Western blot显示,pHBLV-CMV ROP16过表达组ROP16蛋白相对表达量高于空白组和空载体组(t值分别为15.67、15.13,P<0.05),炎性小体NLRP3与Caspase-1蛋白相对表达量高于空载体组和空白组(t=22.22、11.29,P<0.05)。结论构建的过表达ROP16重组慢病毒可在THP-1细胞内稳定表达ROP16蛋白,且定位于THP-1细胞核。该蛋白通过调节NLRP3炎性小体进一步促进细胞炎性反应的发生。