医学遗传与胚胎发育混合式教学评价体系构建研究

为达到一流课程建设要求,有利于学生自主学习,有效打通课内课外,提高教学效率的同时保证教学质量,上海交通大学基础医学院在超星泛雅网络教学平台构建基础上,实践医学遗传与胚胎发育整合课程线上线下混合式形成性评价体系,借助现代化教学技术和方法,全程反馈激励,以激发学习动力和专业志趣,提升教学效果,达到上海交通大学人才培养目标,即培养有灵魂的卓越创新医学人才。

潮霉素和新霉素抗性基因转基因小鼠的建立及其表达研究

建立潮霉素 (hygromycin ,hyg)和新霉素 (neomycin ,neo)抗性基因转基因小鼠系 ,以获得两种抗性基因同时表达的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) ,为条件性基因剔除或小鼠胚胎干细胞克隆的筛选创造条件。将pTK hygR pA ,PGK neoR pA两个转录单元分别克隆至pBluescript载体中获得hygR neoR 双抗性基因表达质粒 ,以KpnⅠ和XbaⅠ双酶切 ,回收 4 2 4 5bp串联基因片段 ,经显微注射获得HygR neoR 转基因小鼠。PCR及Southernblot鉴定转基因小鼠基因型 ;RT PCR检测hygR、neoR 基因在转基因阳性小鼠组织及MEFs中的表达。经显微注射共获得 7只转基因阳性小鼠 (Founders,G0代 ) ,经交配繁育 ,建立了 6个转基因小鼠系。RT PCR检测其中 5个转基因阳性小鼠系F1代杂合子成年雌性小鼠肝脏、卵巢组织中hygR 、neoR 基因的表达 ,发现hn30 ,hn33,hn6 6和hn6 7系阳性小鼠的 1种或 2种组织中有hygR 、neoR 的表达 ;RT PCR检测发现hyg和neo抗性基因在从hn30和hn6 6系分离培养的MEFs中表达。通过显微注射 ,建立了表达hyg neo抗性基因的转基因小鼠系 ,转基因表达检测发现两个转基因小鼠系的胚胎成纤维细胞中表达双抗性基因。

基因捕获技术

基因捕获技术是一种产生大规模基因突变的便利手段,对于揭示大量基因序列所对应的基因功能具有重要应用价值。本文综述了基因捕获技术的基本原理和研究方法、发展现状及远景。

Adiponectin基因剔除LacZ基因敲入小鼠模型的建立

adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件.

hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的 定点突变法扩增制备完整hHGF αcDNA ,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果 以含有人HGFcDNA全序列的质粒 pRC/CMV hHGF为模板 ,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应 (PCR) ,扩增hHGF αcDNA基因 ,琼脂糖凝胶电泳检测 ,结果显示扩增得到了 1 34kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶XhoⅠ酶将其切为 386bp、95 4bp两个片段 ,分别以EcoRⅠ /XhoⅠ、XhoⅠ /BamHⅠ与 pBSKS载体连接重组 ,对目的基因分段克隆后进行序列测定 ,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoRⅠ、BamHⅠ识别位点外 ,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGFcDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoRⅠ /XhoⅠ、XhoⅠ /BamHⅠ从pBSKS HGF α 386、pBSKS HGF α 95 4中切出的 386bp、95 4bp两个片段以EcoRⅠ /BamHⅠ与pBV2 2 0连接构建重组表达质粒 pBV2 2 0 HGF α ,限制性内切酶图谱分析显示HGF αcDNA插入到载体pBV2 2 0的EcoRⅠ /BamHⅠ位点 ,插入方向正确。温度诱导表达 ,SDS PAGE显示一分子量与单体hHGF α链吻合的蛋白带 ,证明表达质粒构建成功。结论 设计制备了hHGF α链cDNA ,克隆建立了hHGF α链原核表达质粒。

重组人肝细胞生长因子重链在大肠杆菌中的表达研究

目的 观察经过转录前加工、修饰后克隆至表达载体pBV2 2 0中的人肝细胞生长因子α链cDNA在大肠杆菌的表达情况 ,优化表达条件 ,以建立hHGFα原核高效表达体系 ,并进一步研究hHGF -α蛋白的生物学功能。方法与结果 将重组表达质粒pBV2 2 0 hHGF α转化大肠杆菌DH5α、Plyss ,通过升温诱导法 ,即将温度由 30℃升高到 42℃ ,诱导外源基因表达。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测hHGF α蛋白表达 ,电泳图谱显示一特异的分子量与单体hHGF α链吻合的蛋白带。SDS PAGE光密度扫描对外源基因表达产物进行初步定量 ,表达产物分别占细菌可溶性蛋白总量的 2 5 %、30 %。进一步行West ern blot对表达产物进行定性 ,外源基因表达蛋白与特异的hHGF α抗体呈阳性反应。结论 成功地建立了hHGF

医学遗传与胚胎发育整合课程的问卷调查与分析

采用问卷调查等方法分析2010-2016级临床医学专业八年制学生对医学遗传与胚胎发育整合课程教学的满意度。结果显示超过85%的学生对整合课程的总体印象、课程目标、内容安排、大纲编制、案例分析和师资力量表示满意。但整合课程内部及与其他整合课程之间的无缝对接尚需加强。

医学生对医学遗传学本科教学满意度的问卷调查及分析

为了解上海交通大学医学院本科生对医学遗传学教学的满意度,采用自编问卷调查,同时召开学生座谈会,多方位收集学生的反馈信息。医学生对医学遗传学教学的总体满意度良好。建议适当调整教学内容,改进教学方法,完善考核形式,以促进本科教学质量的进一步提高,并为深化教学改革提供依据。

BPOZ基因纯合缺失ES细胞系的建立及其生长和分化研究

研究BPOZ基因缺失对细胞生长和分化的影响.以高浓度的G418筛选BPOZ基因杂合缺失型ES细胞,PCR鉴定抗高浓度G418细胞克隆基因型;半定量RTPCR分析3种基因型ES细胞BPOZ基因的表达情况,分析3种基因型ES细胞Oct34基因的表达以明确ES细胞分化状态.利用3种基因型ES细胞进行细胞生长曲线和3H胸嘧啶核苷参入实验比较其生长速度和增殖能力.以裸鼠荷瘤实验和类胚体形成实验比较BPOZ基因纯合缺失型ES细胞与野生型ES细胞生长分化能力.结果表明,筛选获得两个BPOZ基因剔除的纯合ES细胞克隆;筛选得到的纯合ES细胞中BPOZ基因表达完全缺失,细胞处未分化状态.与野生型ES细胞相比,BPOZ基因纯合缺失型ES细胞生长受抑,增殖能力减弱.BPOZ基因纯合缺失型ES细胞可分化形成类胚体和具备来自3个不同胚层的细胞和组织的畸胎瘤.BPOZ基因剔除使ES细胞生长受抑,对ES细胞分化发育没有明显影响.

靶向凝血因子FⅨa-FⅧa复合物结合位点的新型抗栓抗体

目的·制备以内源性凝血途径中关键的凝血因子Ⅸa(coagulation factorⅨa,FⅨa)为靶点的单克隆抗体,并研究其抗栓功能及作用机制。方法·通过免疫小鼠、杂交瘤技术、单克隆抗体细胞表达纯化技术,制备高纯度的抗FⅨa单克隆抗体;通过酶联免疫吸附测定筛选与FⅨa具有高亲和力的单抗,利用活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶原时间(prothrombin time,PT)评估单抗的抗栓效果;然后利用发色底物法检测其对FⅨa酶活性的影响;采用计算机模拟蛋白-蛋白对接的方法预测抗体与FⅨa相互作用可能的结合位点,并通过竞争实验(间接通过发色底物法)对这一结合位点进行验证。结果·制备得到1种高亲和力抗FⅨa的单克隆抗体FⅨa-4;虽然它不影响PT和FⅨa的酶活性,但可显著延长APTT至88.8 s,是对照组(25.5 s)的3.5倍,并且具有浓度依赖性。蛋白-蛋白对接预测结果发现,FⅨa-4不直接与FⅨa的底物催化位点结合,而是占据了FⅨa和FⅧa的结合区域。竞争实验进一步验证了上述结果,FⅨa-4以剂量依赖的方式抑制FⅩa的生成,FⅨa-4的浓度达到400 pmol/L即可使FⅩa的生成几乎完全被抑制,而FⅧa可纠正抗体的抑制作用达到近50%。结论·获得抗FⅨa的单抗FⅨa-4;FⅨa-4与FⅧa竞争性结合FⅨa阻碍了FⅧa-FⅨa复合物形成,阻断FⅩ向FⅩa的转化,该抗体主要通过抑制内源性凝血途径发挥抗栓作用。

采用病人进课堂的教学方法促进遗传性疾病案例教学体系的建立

在我校2016-2017级五年制医学生遗传性疾病案例教学中邀请真实病人和医生到课堂与师生访谈交流。课后采用问卷调查、采访、反馈意见采集等方式分析评估了这种教学方式的效果及其在案例教学体系建立中的作用。

杜氏肌营养不良症治疗研究进展

杜氏肌营养不良症(DMD)是由于DMD基因发生突变导致的X连锁隐性遗传病,目前尚无有效的治疗方法。随着对该病的发病机制和病理变化过程逐渐深入地认识,近年来研究者从多方面探索治疗该疾病的方法和效果,包括抑制炎症、调节钙水平、促进肌肉生长、抗纤维化等对症治疗药物,辅助训练设备,基因替代、外显子跳跃、基因编辑等基因治疗方案,以及干细胞治疗。本文综述了DMD治疗方法的最新研究进展。

研究生《医学分子遗传学》课程建设的实践与建议

为了提高研究生培养质量，上海交通大学医学院为研究生开设了《医学分子遗传学》课程。课程组聘请多名教授，采用讲座形式，讲授学科前沿进展，着重启发学生发现和解决问题，培养学生实际应用和创新能力，取得良好教学效果。课程组通过分析近两届研究生对该课程评价的调查问卷，提出采用多元化教学模式、强化与学生的教学内容信息交流、多元综合评价及强化课程协调管理等进一步深化该课程改革的建议。

血小板功能的研究进展

血小板通过其表面的多种受体和释放血小板颗粒发挥功能，参与多种生理病理过程。血小板通过表面受体与受损内皮黏附后，引发血小板进一步活化、聚集，参与止血与血栓形成；通过与白细胞、内皮细胞间的相互作用，参与炎症发生的过程；通过促进肿瘤血管生成、协助肿瘤细胞逃避机体免疫及促进肿瘤细胞对内皮的黏附和侵袭，参与肿瘤发生的进程；通过产生AB40、释放炎症介质、促进血液高凝状态等加重大脑淀粉样血管病（CAA）病变，从而参与阿尔茨海默病（AD）的发生。笔者拟就血小板功能的研究进展进行综述如下。

CAR-T细胞免疫疗法的现状及展望

肿瘤细胞免疫治疗被公认为是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法,免疫疗法嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞疗法(CAR-T),属于过继性细胞免疫治疗,不仅在肿瘤治疗中取得突破性进展,在感染性疾病和自身免疫性疾病等治疗中也有良好的应用前景.现就CAR-T细胞免疫疗法的发展历史、临床应用、目前存在的问题以及最新研究成果作一综述.

血小板在肿瘤生长和转移中的作用

血小板的数量和活性增加与肿瘤转移相关，血小板主要通过促进免疫逃避、黏附作用以及血管生成参与肿瘤转移进程。最新研究显示血小板与肿瘤细胞间的直接相互作用对肿瘤的转移也具有重要的促进作用。血小板促进肿瘤进展和转移的作用提示血小板可以作为肿瘤治疗的新靶点。