灵芝酸通过髓样分化蛋白2调控小胶质细胞活化改善小鼠脑缺血损伤

目的灵芝酸是灵芝的主要生物活性成分之一,具有免疫调节及抗炎的作用。本研究旨在观察灵芝酸对小鼠脑缺血损伤是否具有保护作用及可能的作用机制。方法通过线栓法缺血60 min再灌注制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型。小鼠随机分为假手术组、假手术给药组、模型组和灵芝酸治疗组。灵芝酸(1.25,5和20 mg·kg^(-1))于再灌同时ip给药。体外实验应用经典的脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞神经炎症损伤模型。结果灵芝酸可呈剂量依赖性改善小鼠脑缺血后神经功能缺失、减小脑梗死体积、减轻脑水肿程度。与模型组相比,灵芝酸治疗组可显著抑制脑缺后神经元的凋亡,抑制小胶质细胞过度激活,减少损伤侧脑组织中炎症相关蛋白iNOS,COX-2和TNF-α的表达,NF-κB及MAPK信号通路的蛋白(ERK,JNK和P38)磷酸化水平也显著降低。体外实验结果表明,灵芝酸同样可呈剂量依赖性地减少LPS诱导后小胶质细胞炎症相关蛋白iNOS,COX-2和TNF-α的表达水平,并抑制NF-κB及MAPK信号通路。我们利用超高效液相色谱-串联质谱检测灵芝酸的组成,并将含量较高的单体进行提取和纯化,通过ELSIA法筛选有效的抗炎单体,应用表面等离子共振技术、蛋白芯片技术、分子对接技术以及免疫共沉淀等方法对筛选出的灵芝酸可能的作用靶点进行检测和验证。结果表明,灵芝酸混合物主要由19种灵芝酸单体组成,其中含量较高的8种单体均可抑制小胶质细胞炎症因子的分泌,并且髓样分化蛋白2(MD2)可能为灵芝酸抑制小胶质细胞炎症反应的关键靶点,灵芝酸单体可通过与MD2结合,抑制其与TLR4形成复合物,进而影响下游的NF-κB及MAPK信号通路。在8种灵芝酸单体中灵芝酸K的抗炎活性最为突出,且与MD2亲和力也最强。MD2基因敲除及MD2基因敲除后给予灵芝酸对小胶质细胞炎症反应及脑缺血再灌注损伤的实验结果表明,脑缺血再灌注损伤后,损伤侧脑组织中MD2的表达明显升高,MD2基因敲除后显著抑制脑缺血再灌注后小胶质细胞的过度激活。并且MD2基因敲除可抑制LPS引起的小胶质的炎症反应,减少脑缺血再灌注后脑梗死体积,在MD2基因敲除基础上给予灵芝酸,以上作用无显著差异。表明灵芝酸发挥脑缺血再灌注损伤保护作用依赖于MD2。结论灵芝酸具有抗脑缺血损伤的作用,其机制主要是通过与MD2结合,抑制MD2与TLR4形成复合物,下调MAPK及NF-κB信号通路,进而抑制小胶质细胞过度激活,减少炎症因子的表达。