细胞生物学课程全英文教学实践与探索

全英文教学是促进高校教育国际化的重要手段,结合4年来浙江理工大学细胞生物学全英文课程的教学实践,从课程概况、教学方法探讨、考核方式、存在问题等方面阐述细胞生物学课程全英文教学的实践过程,总结全英文教学过程中的经验和存在问题,提出今后教学改革的措施,从而提高全英文教学水平,促进细胞生物学全英文教学模式的健康发展。

猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立

猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的最小的动物病毒.主要引发猪断乳后多系统衰竭综合征(PMWS),该病主要特征是猪进行性消瘦、多系统病理损伤,严重影响断乳猪生长发育.对PCV和PMWS的一系列研究表明,PCV在猪体内长期演变过程中,产生了有致病性的变异株,称为PCV2;相应地将没有致病性的持续污染PK15细胞的毒株称为PCV1.PCV1是无致病性的,广泛存在于猪群中,而PCV2是致病性的,能引起多种疾病综合征.

马传染性贫血病毒LTR在驴胎皮肤细胞中的基因进化及启动子活性比较

将EIAV驴白细胞弱毒疫苗株在驴胎皮肤细胞中连续传代,分别提取第13代、18代、21代、23代、26代病毒培养物的前病毒DNA,以LTR特异性引物PCR扩增前病毒LTR,并进行克隆及测序分析。与本实验室已测定的驴白细胞毒株LTR的序列比较发现,驴胎皮肤细胞毒株LTR的U3负调节区出现大段的插入、点突变、缺失,U3增强子区变异较小。将LTR片段插入到pCAT-basic载体CAT报告基因前,转染驴胎皮肤细胞,通过检测CAT表达量来评价LTR的启动子活性。驴胎皮肤细胞毒株LTR的启动子活性随着病毒传代次数的增加而逐渐增强,而驴白细胞弱毒株LTR的启动子活性很低。

猪圆环病毒2型分离株的基因组克隆、序列测定与分析

设计合成两对覆盖PCV2基因组全长的引物,对PCV2分离株S2、P11、L进行全基因测序。将所测序列与GenBank上已公布的PCV2毒株序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株与其它地域的24株PCV2分离株的基因组序列同源性很高。3个分离株之间的全基因核苷酸同源性在95.4%～99.3%。序列分析表明欧洲分离株和美洲分离株分别构成PCV2的两个大的分支:欧洲系和美洲系。S2、P11属于欧洲系,L属于美洲系。

马传染性贫血病毒第1 9、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA全基因序列分析

不同代次马传染性贫血驴胎皮肤细胞弱毒(Fetal donkey dermal virus,FDDV)的免疫保护效果各不相同,只有第10～15代驴胎皮肤细胞弱毒具有良好的免疫保护效果,可作为疫苗使用,继续传代则疫苗的保护率下降。为确定有、无免疫保护效果的FDDV在基因水平上的差异,本实验对无免疫保护效果的第19、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA进行了全基因序列测定,并与已测序的疫苗毒株进行序列比较。第19代和第26代FDDV全基因核苷酸序列同源性高达99.5%,与疫苗毒株全基因核苷酸序列的同源性分别为96.9%、96.7%。LTR是EIAV在细胞传代中变异最显著的区域,第19、26代FDDV的LTR与疫苗毒的LTR同源性仅为89.6%、89.3%。马传贫病毒的gag基因高度保守,第19、26代FDDV与疫苗毒株的gag基因推导氨基酸序列仅有2个氨基酸不同。第19、26代FDDV与疫苗毒株的pol基因、env基因的推导氨基酸序列的同源性分别为98.9%、98.8%、93.7%、93.6%。由序列比较结果可以推断,第19代、第26代FDDV不具有免疫保护效果的主要原因可能是由于LTR和env基因的变异,导致病毒复制能力下降或免疫原性丧失,不能诱导机体产生良好的免疫反应。

猪圆环病毒间接免疫荧光方法的建立

将接种PCV2且经多次传代的PK-15带毒细胞分散到96孔细胞培养板上,制成抗原诊断板,应用间接免疫荧光技术检测血清中PCV2的抗体。通过对各种反应物的工作浓度与作用时间的优化,建立了PCV2抗体的间接免疫荧光检测技术,可用于PCV2抗体水平的监测,为今后的猪圆环病毒疫苗抗体检测的研究提供了检测方法。

猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立

根据GenBank中20株猪圆环病毒(PCV2)核苷酸序列设计两对引物,建立的检测猪圆环病毒的多重PCR方法,其中引物P1、P2为PCV特异性,扩增938bp片段。P3、P4为PCV2特异性扩增490bp,因此本方法不仅可以扩增PCV片段,还可以同时区分PCV1和PCV2。该方法具有良好的特异性和敏感性,为猪圆环病毒的临床诊断与流行病学调查等研究奠定了基础。

马传染性贫血病毒N-连接糖基化回复突变的感染性克隆构建

根据马传贫强毒株EIAV-L和疫苗株EIAV-FDD表面蛋白gp90的N-连接糖基化的变化规律,采用PCR定点突变的方法,对全长感染性克隆pLGFD3-8上的N-连接糖基化的差异区域进行改造后,构建成含有3个N-连接糖基化位点突变的感染性克隆pLGN191N236N246。将其转染驴胎皮肤细胞(FDD),通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性。结果表明,在FDD细胞中盲传三代后,在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性,RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性,电镜下见到典型的EIAV颗粒。这一结果可能对N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础。

家蚕亲环蛋白A基因(BmCyPA)的克隆与表达分析

亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。

快速实时荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合症病毒方法的建立

为建立一种快速准确检测猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的基于TaqMan实时荧光定量PCR方法,根据猪繁殖与呼吸综合症病毒的ORF7保守序列分别设计引物和TaqMan探针,在常规PCR的基础上,设计并优化基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测PRRSV的方法。结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR体系相关系数大于99%,扩增效率为97%,具有良好的线性关系。利用建立的方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本脑炎病毒(JEV),结果均为阴性,说明此方法具有较好的特异性。灵敏度试验表明该方法检测极限为5copies/μL;应用建立的方法对58份血清样本和60份组织样本进行检测,共检测出14份阳性血清和10份阳性组织。这些结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的PRRSV实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏度、重复性,可为临床检测PRRSV提供更高效的技术平台。

细胞生物学实验开放式教学模式实践研究

细胞生物学是现代生命科学的基础和前沿性学科,在生命科学教育中占有核心地位。人才综合素质靠加强综合训练来培养,而创新实践能力则主要靠加强实验教学和实践训练。在本研究中,笔者尝试对本校本科生细胞生物学实验课程教学方法进行革新,打破以往单一的实验教学模式,采用开放式实验教学模式,在全面优化实验教学内容的基础上,进一步完善了适应于开放式教学的实验室条件,建立了新的实验考核制度。通过近三年的实践,学生的学习热情显著提高,创新意识和实践能力均显著增强,同时也提升了学生就业、考研等方面的综合竞争能力。本研究成效明显,可为深入探索行之有效的生命科学实践教学模式提供参考。

SPOC教学法在细胞生物学教学中的应用

细胞生物学是现代生命科学的基础和前沿学科,在生命科学教育中占有核心地位。为促进该课程教学质量的提高,笔者尝试将SPOC"翻转课堂"教学法应用于该是课程教学。经过两年的教学实践,学生的学习热情、自主学习能力等均显著增强。

家蚕膜蛋白基因(BmTmC27)的序列分析及组织特异性和原核表达

从家蚕蛹cDNA文库中筛选获得一条家蚕膜蛋白基因序列,通过编码氨基酸序列的同源性比对表明其可能是家蚕的未知功能序列,命名为BmTmC27(GenBank登录号:DY231073.1)。生物信息学分析结果表明该基因全长833 bp,由558 bp的开放阅读框、102 bp的5'端非翻译区和173 bp的3'端非翻译区组成,编码蛋白由185个氨基酸组成且含有4个跨膜区,预测蛋白分子质量为20.94 kD,等电点为7.38。将该基因片段与BmNPV的polh基因连接后克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核融合表达载体pGEX-4T-1-polh-BmTmC27,经IPTG诱导、SDS-PAGE分析表明目的蛋白以包涵体形式在E.coli BL21(DE3)中表达。利用多角体蛋白可溶于碱性环境的性质,采用调节pH值的方法纯化融合表达的重组蛋白GST-Polh-BmT-mC27,然后经TEV酶消化获得BmTmC27蛋白。荧光定量PCR分析BmTmC27在家蚕5龄幼虫不同组织中的表达存在明显差异,其中在脂肪体、中肠和气管中的转录水平较高。利用GST沉降技术研究了BmTmC27的互作蛋白,与对照组相比,发现了4条特异性互作蛋白条带。研究结果有助于进一步探究BmTmC27的生物学功能,也为膜蛋白的表达和纯化提供了一种新方法。

家蚕核型多角体病毒基因bm64的表达及定位分析

对家蚕核型多角体病毒（Bm NPV）功能未知基因的研究,有利于全面揭示病毒的复制和感染机制。依据NCBI数据库发表的Bm NPV T3株基因组序列（Gen Bank登录号：L33180.1）,选择未知功能基因bm64进行生物信息学分析,该基因ORF全长333 bp,编码110个氨基酸,预测蛋白质分子质量为12.71 k D,等电点4.21。将Bm64蛋白亲水区1～49 aa的编码序列与原核表达载体p GEX-4T-3连接,构建重组表达质粒,转化E.coli Rosetta菌株后进行诱导表达。SDS-PAGE检测在预测分子质量处有明显的蛋白质条带,纯化该蛋白质并以此为抗原免疫新西兰大白兔,制备Bm64蛋白多克隆抗体。在病毒感染Bm N细胞后24 h即可用Western blot方法检测到Bm64蛋白的表达。通过间接免疫荧光检测到Bm64蛋白在Bm NPV感染的Bm N细胞中表达,并定位于细胞核。研究结果为进一步分析家蚕核型多角体病毒bm64基因的功能奠定了实验基础。

家蚕核型多角体病毒ie0基因对病毒复制和转录的影响

ie0基因是家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的一个晚期基因,该基因编码氨基酸序列的高度保守性及多种结构域提示其在病毒感染过程中的重要性。利用Red同源重组技术,分别对BmNPV ie0基因编码不同结构域的序列以及完整序列进行敲除构建ie0缺失型病毒,以野生型病毒为对照,研究ie0序列完全或部分缺失对病毒转录、复制及对宿主细胞致病能力等方面的影响。结果表明ie0基因完整序列或编码各结构域的序列缺失后均会对病毒产生不同影响:宿主细胞中完全缺失型和部分缺失型病毒滴度均有不同程度降低;完全缺失型和部分缺失型病毒基因组的拷贝数均与野生型病毒无显著差异;部分缺失型病毒的晚期和极晚期基因转录水平变化与ie0基因完全缺失型病毒相一致,均显著低于野生型病毒,并且缺失锌指结构域编码序列的影响最为明显。MTT检测结果也显示ie0基因完全缺失后病毒对宿主细胞的致病能力有所下降。亚细胞定位显示IE0蛋白在细胞质、细胞核中均有分布,但主要位于细胞质。综上所述,ie0基因为BmNPV病毒增殖、基因组复制的非必需基因,但对病毒晚期和极晚期基因的转录具有调控作用,影响最为显著的为锌指结构域的编码序列,且该基因的缺失会导致病毒对宿主细胞的致病能力有所下降。

Wiki对大学生细胞工程课程主题学习的支持研究

随着信息技术的不断发展,学生获取学习资料的途径变得更广泛、内容也更加丰富。随之,学习的方式也发生了根本性的变化,出现了在线学习、自主学习和协作学习等多种学习形式。传统的课堂学习方式己不能满足信息时代学生学习的需要,尤其对于大学生这一独立性和协作性较强的群体。在此背景下,基于网络的主题学习形式逐渐受到了人们的重视。但如何才能提高网络环境下主题学习的效果,尤其是像发展较快的生物技术专业中的相关课程,如细胞工程课程等。本文以细胞工程课程为例,初步探讨Wiki(微客或维基)在大学生主题学习活动中的作用及优势。

普通高校生物技术专业实验教学体系改革探索

普通高校生物技术专业是以培养应用型人才为主的专业。本文通过分析对比传统的和新型的实验教学体系之间的差异，围绕我校生物技术专业人才培养的培养目标和实验教学体系改革两个方面，探索了生物技术专业实验教学体系改革中应用型人才培养的新模式。

猪圆环病毒2型ORF4基因的原核表达及多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，ORF4是PCV2中继ORF1，ORF2，ORF3之后的第四大开放阅读框。本研究以提取的PCV2基因组为模板经PCR扩增获得ORF4基因（386～565 nt），并克隆到pGEX-4T-1表达载体上，构建pGEX -4T-ORF4表达载体。经PCR和测序鉴定后，将重组质粒转化受体菌BL21诱导表达并进行目的蛋白GST-ORF4纯化，然后用纯化的蛋白免疫新西兰兔，在免疫期间采血并用间接ELISA对多抗血清进行效价测定。 SDS-PAGE电泳检测结果表明，重组质粒成功表达了目的蛋白。 ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶12800以上。 Western blot分析表明ORF4融合蛋白具有很好的免疫原性，获得的抗体可以和大肠杆菌表达的GST-ORF4融合蛋白特异性反应。

猪圆环病毒的基因密码子偏好性分析

为了解不同型猪圆环病毒(PCV)(PCV1、PCV2、PCV3)的密码子使用特点及其主要影响因素,本研究通过生物信息学方法对3个型PCVs的rep和cap两个基因序列的密码子偏好性进行综合分析。结果显示3个型PCVs间、rep与cap两个基因间、PCVs与宿主间的密码子偏好性均存在明显差异。密码子适应指数(CAI)分析预示3个型PCVs的两个基因在宿主细胞中表达水平低。同义密码子的相对使用频率(RSCU)分析表明PCV1与PCV2具有相似的同义密码子使用模式,而PCV3与PCV1、PCV2存在明显差异,3个型PCVs与宿主的密码子偏好性也存在明显差异。rep基因偏好使用U或G结尾的同义密码子,cap基因偏好使用C结尾的同义密码子。通过中性绘图分析和ENC绘图分析显示,PCV的密码子使用模式受自然选择压力影响大,受突变压力的影响小。本研究为阐明PCV的分子进化规律及病毒对宿主翻译系统的适应性提供重要的实验依据。

家蚕核型多角体病毒凋亡抑制基因iap的功能分析

在昆虫杆状病毒基因组中普遍存在一类凋亡抑制基因iap(inhibitor of apotosis)。核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的iap1和iap2基因为研究对象,分别构建BmNPV iap1、BmNPV iap2缺失型和补回型病毒,探究2个iap基因的生物学功能。病毒基因组DNA对BmN细胞的转染实验结果表明,BmNPV iap1基因缺失对病毒感染引起的细胞凋亡无显著影响,对病毒基因组的复制和基因转录也无明显影响;但BmNPV iap2基因的缺失可显著提高细胞的凋亡水平(P<0.05),当利用iap2缺失型病毒基因组DNA转染BmN细胞时,胞内凋亡启动蛋白Caspase-3的活性与野生型病毒转染组相比显著上升,并且病毒滴度降为0。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明,BmNPV iap2的缺失大大降低了病毒DNA的复制水平和基因转录水平。基于上述试验结果可知:BmNPV iap2具有抑制由病毒感染诱导的细胞凋亡的作用,并且是病毒增殖的必需基因;而BmNPV iap1对宿主细胞的凋亡没有明显调控作用,对病毒基因组DNA的复制和基因转录也没有明显影响。