基于CRISPR/Cas9技术构建SIRT6基因敲除的A549肺腺癌细胞系

目的应用CRISPR/Cas9技术构建SIRT6基因敲除的人肺腺癌A549稳转细胞系。方法根据CRISPR/Cas9技术靶点设计原则,通过生物信息学设计向导RNA(single-guide RNA sgRNA),构建sgRNA-SIRT6质粒并包装成慢病毒感染A549细胞,使用嘌呤霉素筛选SIRT6基因敲除的A549细胞并行基因组测序鉴定,应用Western Blot检测SIRT6基因的敲除情况。结果DNA测序结果显示sgRNA-SIRT6重组质粒构建成功,Western Blot结果显示,转染sgRNA-SIRT6重组质粒的细胞无SIRT6表达。结论通过CRISPR/Cas9技术成功构建了SIRT6基因敲除的A549细胞系,为后续研究SIRT6基因在肺腺癌细胞中的作用机制和功能奠定了基础。

lncGAS5通过NCAM1调节细胞自噬抑制A549细胞增殖

目的研究长链非编码RNA GAS5通过神经细胞黏附分子1(neural cell adhesion molecule 1,NCAM1)调节非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549细胞增殖机制。方法CCK8法分别检测Control组、LV-sg-NC组(空载体的慢病毒转染A549细胞作为阴性对照组)、LV-sg-lncGAS5组(携带sg-lncGAS5的慢病毒转染A549细胞作为实验组)OD值及A549细胞相对存活率。QPCR分别检测Control组、LV-sg-NC组、LV-sg-lncGAS5组A549细胞中lncRNA GAS5及NCAM1的表达。免疫荧光实验检测在A549细胞中过表达及敲降lncRNA GAS5后,微管相关蛋白1A/1B-轻链3(MAP1LC3、LC3)的表达;检测过表达NCAM1后,LC3的表达,并在过表达NCAM1的A549细胞中加入ERK抑制剂,检测LC3的表达。结果抑制lncGAS5表达后,A549细胞相对存活率增高(P<0.001)。并且A549细胞感染sg-lncGAS5病毒后可发现lncGAS5表达下调(P<0.001),NCAM1表达上调(P<0.001)。过表达lncGAS5的A549细胞LC3的表达上调;而过表达NCAM1的A549细胞LC3的表达下调,ERK通路抑制后,LC3的表达上调。敲降lncGAS5的结果与过表达NCAM1结果一致。结论lncGAS5可通过NCAM1增强A549细胞自噬,从而抑制A549细胞的增殖。