Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的:获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白(GFP)标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法:应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度(0.5和1.0mmol·L-1)和不同温度(22℃和37℃)诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。结果:0.5和1.0mmol·L-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温(22℃)诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。结论:低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。

视神经脊髓炎患者血清中的AQP4抗体检测

目的检测视神经脊髓炎患者血清中的自身免疫性抗体NMO-IgG靶抗原是否为水通道蛋白AQP4。方法利用转染人AQP4质粒的FRT细胞通过免疫荧光及免疫印迹等方法对NMO-IgG的靶抗原进行确认。结果 NMO-IgG对表达AQP4蛋白的FRT细胞(瞬时转染人AQP4基因)进行特异性染色,利用此抗体进行免疫印迹分析能够特异性检测出AQP4蛋白。结论 AQP4是视神经脊髓炎患者血清中自身抗体NMO-IgG识别的靶蛋白,AQP4可能在人视神经脊髓炎的发病过程起重要作用。

水通道蛋白1-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达(简报)

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是一类选择性高效转运水分子的细胞膜通道蛋白，广泛存在于原核和真核生物细胞的细胞膜上．主要介导自由水分子的被动跨膜转运．对保持细胞内外液环境的稳态平衡起着重要的作用。AQP1是第一个被发现鉴定的水通道蛋白．它是1988年Agre等从红细胞膜分离纯化Rh血型多肽时偶然发现的一个分子量为28KD的疏水性跨膜蛋白．称为形成通道整合膜蛋白28（CHIP28）。Agre因此获得了2003年的诺贝尔奖。水通道蛋白AQP1广泛地表达于红细胞、肾、眼、肺，脉络丛和血管内皮，在体液转运中发挥作用。

PAK5在凋亡级联反应中的调节作用

PAK5为PAKs家族中新近发现的成员.PAKs是一类通过与Rac和Cdc42结合而激活的高度保守的蛋白酶.PAKs在细胞骨架、神经生长、激素信号传导、基因转录等生理活动中起着重要的调控作用.PAK5在大脑组织中高度表达,在细胞中定位于线粒体.PAK5与神经生长、增强微管的稳定性以及阻止细胞凋亡等活动密切相关.本文就PAK5的结构、表达部位和功能以及其在调控凋亡级联反应中的作用等方面做了简要综述.

载奥沙利铂类弹性蛋白多肽水凝胶的制备及其对小鼠结肠癌CT26细胞的杀伤作用

目的:制备担载奥沙利铂(OXA)的类弹性蛋白多肽(ELPs)水凝胶,研究其体外药物释放情况及对小鼠结肠癌CT26细胞的杀伤作用。方法:利用大肠杆菌(E.coli)系统表达ELPs原核蛋白,利用可逆相变循环法(ITC)进行蛋白纯化,将ELPs蛋白溶液与交联剂四羟甲基氯化磷(THPC)混匀制备水凝胶,扫描电子显微镜(SEM)观察水凝胶的超微结构,CCK-8法检测不同浓度ELPs水凝胶处理后CT26细胞和小鼠成纤维NIH3T3细胞存活率,活/死细胞染色法观察30和40 g∙L-1 ELPs水凝胶作用48 h后CT26细胞存活情况。制备载OXA的ELPs水凝胶,检测其在不同pH值(6.5和7.4)缓冲液中的药物释放情况,CCK-8法检测加入载不同浓度(0.25、1.00、4.00、16.00和64.00 mg∙L-1)OXA的ELPs水凝胶浸泡液后各组CT26细胞存活率和处理不同时间各组CT26细胞存活率。结果:凝胶电泳分析,E.coli诱导后在预计相对分子质量38000附近出现明显加粗的蛋白条带,ITC纯化后泳道中无明显杂蛋白存在。ELPs蛋白溶液中加入THPC后由透明液体状态转变为不透明的白色水凝胶,SEM观察显示出排列整齐的孔隙和三维结构;CCK-8法检测,经不同浓度ELPs蛋白处理后CT26细胞和NIH3T3细胞存活率仍接近100%;活/死细胞染色,ELPs水凝胶处理后的CT26细胞在荧光显微镜下呈现明亮的绿色荧光。载OXA的ELPs水凝胶能在体外持续释放OXA,在pH值6.5条件下OXA的释放速度较pH值7.4条件下稍快;CCK-8法检测,载不同浓度OXA的ELPs水凝胶浸泡液呈剂量依赖性抑制CT26细胞增殖,且随孵育时间的延长CT26细胞存活率逐渐降低。结论:载OXA的ELPs水凝胶具有持续释放OXA的特性,能够高效且持续地杀伤小鼠结肠癌CT26细胞,可作为一种安全有效的药物递送载体用于抗肿瘤研究。

Tum-5基因对肝细胞癌生长的抑制作用和对血管生成的影响

目的:探讨肿瘤抑素5(Tum-5)基因对肝细胞癌的抑制作用及对血管生成的影响,阐明其参与抗肿瘤生成的作用机制。方法:体外实验选择人肝癌HepG-2细胞,采用不同感染复数(MOI)(0、1、5、10、25和50)的pLXSN和pLXSN-Tum-5病毒颗粒感染72h,MTT法检测各组细胞增殖率。体内构建肝癌H22荷瘤小鼠模型,分为saline组、pLXSN组和pLXSN-Tum-5组,每组5只。saline组小鼠瘤内注射生理盐水,pLXSN组和pLXSN-Tum-5组小鼠瘤内分别注射相应的病毒颗粒(MOI=5),隔日注射,共注射5次。测定各组小鼠移植瘤体积、质量和小鼠体质量,免疫组织化学法检测CD31蛋白在各组小鼠移植瘤组织中的表达,计算微血管密度(MVD)。结果:与pLXSN组比较,不同MOI pLXSN-Tum-5组的细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05);荷瘤鼠瘤内注射结束后,pLXSN-Tum-5组小鼠移植瘤体积和质量均明显小于pLXSN组和saline组(P<0.05或P<0.01);免疫组织化学检测,各组小鼠移植瘤内均有形态不规则的新生血管生成,与saline组和pLXSN组比较,pLXSN-Tum-5组小鼠移植瘤组织MVD平均值明显降低(P<0.05)。结论:Tum-5可通过抑制肝癌组织内新生血管的生成发挥抑瘤作用。

SIRPα工程化外泌体阻断CD47/SIRPα信号轴研究

目的制备分离表达SIRPα受体的外泌体,探讨SIRPα外泌体的结构特性、细胞相容性、细胞内分布及对CD47/SIRPα信号轴的阻断作用.方法通过差异超速离心法从稳定表达SIRPα的HEK293T细胞中分离外泌体;通过动态光散射法(DLS)和透射电子显微镜(TEM)技术分析外泌体的尺寸和形貌特征;Western blotting检测外泌体中SIRPα-GFP融合蛋白的表达;通过MTT法检测外泌体与NIH3T3细胞的相容性;应用荧光成像技术研究外泌体的肿瘤细胞内吞;通过肿瘤细胞与巨噬细胞共孵育实验研究外泌体阻断CD47/SIRPα信号轴带来的肿瘤吞噬效果.结果利用差异超速离心法分离得到尺寸约80 nm的SIRPα外泌体,透射电子显微镜下呈现为尺寸均一的圆球形结构;免疫印迹证实了外泌体上SIRPα的表达;MTT法结果显示SIRPα外泌体具有良好的生物相容性;荧光成像结果显示SIRPα外泌体被B16F10细胞内吞后分散在细胞质中;共孵育实验表明SIRPα外泌体与CD47单抗均能促进骨髓来源巨噬细胞吞噬黑色素瘤细胞.结论成功分离了表面表达SIRPα受体的外泌体;SIRPα外泌体具有良好的细胞相容性;SIRPα外泌体可以成功阻断CD47/SIRPα信号通路,激活了巨噬细胞对肿瘤的吞噬功能.

载阿霉素细胞膜纳米囊泡对黑色素瘤B16F10细胞的杀伤效应

目的:制备人胚胎肾细胞来源的细胞膜纳米囊泡(NVs),其内腔载阿霉素(DOX)得到新型纳米药物载NVs细胞膜DOX(NVs-DOX),探讨NVs-DOX的肿瘤细胞内吞作用及对黑色素瘤细胞的杀伤效应。方法:利用超速离心法提取HEK293细胞膜,脂质体挤出仪对细胞膜进行处理得到细胞膜NVs;应用电转化法将DOX担载于NVs的内腔,得到NVs-DOX,通过动态光散射检测NVs粒径。以不加囊泡细胞为对照组,细胞膜NVs为实验组,采用MTT法检测不同浓度(5、10、20、50和100 mg·L^-1)NVs对NIH3T3细胞的生物相容性。以小分子DOX(10 mg·L^-1)为对照组,不同浓度(0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500和1.000μmol·L-1)NVs-DOX为实验组,采用荧光显微镜成像和流式细胞术检测NVs-DOX在黑色素瘤B16F10细胞中的荧光分布情况;细胞毒性实验,MTT法检测各组细胞存活率;活/死细胞染色法检测NVs-DOX(1μmol·L-1)处理后的B16F10细胞死亡情况。结果:利用细胞膜材料制备平均粒径为254.3 nm的NVs,电转化法得到了粒径约为289.6 nm的NVs-DOX。MTT法检测,不同浓度NVs组NIH3T3细胞存活率均>100%;荧光成像检测,药物孵育3 h后,NVs-DOX组细胞核内荧光强度略低于小分子DOX组;流式细胞术检测,NVs-DOX组的内吞效率(91.07%)略低于小分子DOX组(95.47%);细胞毒性实验,NVs-DOX组与小分子DOX组均显示出对B16F10细胞浓度依赖性的杀伤效应,DOX浓度在0.1μmol·L-1时B16F10细胞存活率<20%,NVs-DOX组与小分子DOX B16F10细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05);活/死细胞染色,NVs-DOX组与小分子DOX组黑色素瘤B16F10细胞中死细胞占总细胞比率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功制备了人胚肾细胞来源的细胞膜NVs及载DOX的新型纳米药物NVs-DOX,NVs-DOX具有较高的肿瘤细胞内吞效率及明显的黑色素瘤细胞的杀伤效应。

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的:构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白(SIRPα-GFP)真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法:将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果:酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论:成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。

LAG3慢病毒质粒构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建淋巴细胞活化因子3(LAG3)-mCherry红色荧光蛋白的LAG3-mCherry慢病毒表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达LAG3-mCherry融合蛋白的细胞系,探讨LAG3-mCherry融合蛋白在HEK293T细胞中的定位。方法:将LAG3质粒和带有mCherry的慢病毒载体分别用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切,构建pEZ-LAG3-mCherry表达载体。将测序正确的质粒利用Lipofectamine 3000转染HEK293T细胞,利用荧光显微镜观察LAG3-mCherry在HEK293T细胞中的表达定位,Western blotting法检测LAG3-mCherry融合蛋白的表达情况。结果:酶切鉴定结果,电泳后重组质粒双酶切后可见约为8012和2066 bp大小的2条DNA条带,与pEZ-Lv-mCherry载体及LAG3基因片段大小相符;DNA测序结果,LAG3基因成功插入到慢病毒表达载体中。荧光显微镜观察,LAG3-mCherry融合蛋白主要在HEK293T细胞膜上表达,少量蛋白滞留在细胞质中。Western blotting法检测,在转染pEZ-LAG3-mCherry质粒中检测到LAG3对应特异性条带。结论:成功构建了LAG3-mCherry慢病毒表达载体pEZ-LAG3-mCherry。通过稳定转染成功制备了稳定表达LAG3-mCherry的细胞系。LAG3-mCherry融合蛋白主要分布于HEK293T细胞的细胞膜上。

免疫检查点TIGIT慢病毒表达载体的构建和稳定表达TIGIT细胞系的建立

目的:构建T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域-绿色荧光蛋白(TIGITGFP)慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP的细胞系,探讨TIGIT-GFP融合蛋白在稳定表达细胞系中的表达情况。方法:将TIGIT质粒和慢病毒载体pLenti-GFP分别采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,凝胶回收后连接构建重组质粒pLenti-TIGIT-GFP。将测序正确的重组质粒转染人胚胎肾HEK293T细胞作为实验组,转染TIGIT质粒的HEK293T细胞作为对照组,转染48 h后荧光显微镜下观察细胞膜上GFP表达情况。将实验组细胞继续培养,采用嘌呤霉素筛选2周后,挑取单克隆扩大培养,荧光显微镜观察细胞膜上GFP表达情况,Western blotting法检测在转染的人胚胎肾HEK293T细胞中TIGIT-GFP蛋白表达情况。结果:酶切鉴定,TIGIT基因成功插入pLenti-GFP表达载体,DNA测序未检测到突变发生。实验组细胞膜上检测到GFP表达。Western blotting法检测,实验组细胞裂解液中检测到TIGIT-GFP特异性条带。结论:成功构建pLenti-TIGIT-GFP慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP融合蛋白的细胞系,TIGIT-GFP融合蛋白主要在稳定细胞系的细胞膜上表达。

基于小热休克蛋白-细胞穿膜肽蛋白纳米粒的siRNA递送系统

利用大肠杆菌表达系统原核表达并纯化小热休克蛋白-细胞穿膜肽融合蛋白(Hsp-Tat);用动态光散射和透射电镜成像分析Hsp-Tat纳米粒的粒径和形貌;用噻唑蓝(MTT)法和活/死细胞染色法研究蛋白纳米粒的细胞相容性;用凝胶阻滞实验检测纳米粒的小干扰RNA(siRNA)复合特性;用激光共聚焦荧光显微镜成像研究蛋白纳米粒的siRNA胞内递送能力.实验结果表明:亲和层析得到高纯度的Hsp-Tat融合蛋白,融合蛋白可自组装成40.2 nm空心球形结构;蛋白纳米粒在HEK-293T细胞上显示出良好的细胞相容性;Hsp-Tat NP与siRNA形成的复合物可阻止siRNA在琼脂糖凝胶中迁移;Hsp-Tat纳米粒能将Cy3-siRNA转运至细胞内,可作为一种安全高效的非病毒核酸递送载体.

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELPmCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELPmCherry融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry融合蛋白进行纯化;通过MTT法探讨ELPmCherry融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果DNA测序结果显示成功构建了ELP-mCherry原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry融合蛋白,通过ITC法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT结果表明:在所有ELP-mCherry蛋白测试浓度下,HEK293T和NIH3T3细胞存活率接近或超过100%.结论成功构建ELP-mCherry原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry融合蛋白,ELP-mCherry融合蛋白在HEK293T和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性.

含RGD肽类弹性蛋白制备及促HUVECs细胞黏附的影响

目的探讨含RGD肽的类弹性蛋白多肽RGD-ELPs和RDG-ELPs与细胞相容性及两种融合蛋白对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)黏附的影响.方法应用大肠杆菌系统表达RGDELPs和RDG-ELPs蛋白,利用可逆相变循环(ITC)纯化两种融合蛋白;通过MTT法及活/死细胞染色法检测两种融合蛋白与人胚肾细胞(HEK293T)的相容性;通过贴壁细胞计数方法检测不同浓度RGD-ELP对体外HUVECs细胞黏附表达的影响.结果利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统制备高浓度的RGD-ELPs和RDGELPs,通过ITC纯化得到了高纯度融合蛋白;MTT法及活/死细胞染色法结果提示RGD-ELPs和RDG-ELPs蛋白具有良好的相容性;细胞黏附实验结果表明:RGD-ELPs浓度越大,HUVEC细胞黏附能力越强,而对照组RDGELPs则未显示出明显的细胞黏附效果.结论成功表达并纯化了RGD-ELPs和RDG-ELPs融合蛋白;两种蛋白均具有良好的细胞相容性;RGD-ELPs蛋白具有明显的促进HUVECs细胞黏附作用.

融合聚精氨酸九肽的小热休克蛋白原核表达及蛋白纯化

目的构建小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,表达纯化融合蛋白.方法在小热休克蛋白表达载体的基础上利用点突变方法引入聚精氨酸九肽对应序列,转入BL21大肠杆菌感受态细胞进行原核表达,利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化.结果成功构建了融合聚精氨酸九肽的HSP16. 5融合蛋白表达载体,并对其在大肠杆菌细胞中的原核表达进行条件优化,研究显示:在诱导剂IPTG浓度为0. 5 mmol、37℃条件下诱导4 h目的蛋白产量较高.结论此实验成功构建了小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,得到了高纯度的小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础.

肿瘤归巢肽-近红外荧光蛋白融合蛋白的制备及其荧光特性

目的:构建肿瘤归巢肽(THPs)-近红外荧光蛋白(NIRFP)miRFP670-LyP1融合蛋白的原核表达载体,纯化融合蛋白,研究融合蛋白的近红外荧光特性。方法:采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ对pmiRFP670-N1质粒和pET-28a质粒进行双酶切,构建pET-miRFP670原核表达载体,通过点突变引入LyP-1的DNA序列,构建重组表达载体pET-miRFP670-LyP1;将测序正确的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21细胞中,SDS-PAGE电泳法检测不同温度(16℃和37℃)、不同异丙基硫代半乳糖苷浓度(0.1、0.5和1.0 mmol·L^(-1))诱导下融合蛋白原核表达量;采用Ni-NTA树脂亲和纯化融合蛋白,检测miRFP670-LyP1蛋白原核表达量;采用荧光显微镜观察乳腺癌4T1细胞中miRFP670-LyP1融合蛋白的细胞内吞形态表现。结果:检测到长度约为5343和973 bp的DNA条带,与pET-28a载体及miRFP670基因片段大小相符。DNA测序,LyP1序列成功插入至pETmiRFP670表达载体中。在16℃时miRFP670-LyP1融合蛋白的可溶性蛋白表达量较37℃时更高。采用Ni-NTA树脂纯化得到了高纯度的miRFP670-LyP1融合蛋白。荧光成像,miRFP670-LyP1融合蛋白可被乳腺癌4T1细胞高效内吞。结论:成功构建了pET-miRFP670-LyP1原核表达载体,融合蛋白在低温(16℃)较常温(37℃)诱导的可溶性蛋白表达量更高,亲和层析得到了高纯度的融合蛋白,融合蛋白被乳腺癌4T1细胞高效内吞并显示出近红外荧光。

载奥沙利铂细胞膜囊泡纳米药物的制备及其对小鼠结肠癌细胞的杀伤作用

目的:制备内腔担载奥沙利铂(OXA)的细胞膜纳米囊泡(NVs),得到纳米药物NVs@OXA,探讨NVs@OXA对小鼠结肠癌细胞的内吞和杀伤效应。方法:利用超速离心法分离HEK-293T细胞的细胞膜,通过脂质体挤出仪制备NVs,动态光散射检测NVs粒径,透射电子显微镜下观察NVs的超微结构。检测含有不同浓度(5、10、20、50、75和100 mg·L-1)NVs作用后小鼠树突状DC2.4细胞的存活率。激光共聚焦荧光显微镜成像分析囊泡的细胞内吞情况。采用电击法或孵育法将OXA装载于囊泡内腔,获得纳米药物NVs@OXA。检测纳米药物NVs@OXA的装载效率和粒径变化。以游离OXA(游离OXA组)作为对照,MTT法检测含有不同浓度(1.0、2.5、5.0、10.0和15.0μmol·L-1)NVs@OXA(NVs@OXA组)结肠癌CT26细胞的存活率,流式细胞术检测各组小鼠结肠癌CT26细胞凋亡率。结果:采用细胞膜制备平均粒径为222.2 nm的NVs。细胞相容性检测,所有NVs处理的小鼠树突状DC2.4细胞存活率均>100%;电击法制备的OXA装载效率高于孵育法;纳米药物制备12 d内OXA粒径尺寸未见明显变化;激光共聚焦荧光显微镜下,NVs@OXA能成功进入结肠癌CT26细胞内;MTT法检测,在OXA浓度为10和15μmol·L-1时,NVs@OXA组结肠癌细胞的存活率低于游离OXA组(P<0.05)。流式细胞术检测,NVs@OXA组结肠癌CT26细胞凋亡率高于游离NVs组(P<0.05)。结论:利用NVs成功制备了内腔载有OXA的纳米药物NVs@OXA,电击法较孵育法制备的OXA装载效率更高,纳米药物可以被CT26结肠癌细胞高效内吞;纳米药物具有较游离OXA更强的肿瘤杀伤作用。

热聚体Thermosome蛋白的纯化与组装体表征

目的表达纯化热聚体Thermosome蛋白,探讨Thermosome蛋白组装体基本特性与细胞相容性.方法将Thermosome原核表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达Thermosome的α和β亚基蛋白,利用凝胶过滤层析法纯化目的蛋白;利用动态光散射和透射电子显微镜分析Thermosome蛋白组装体的粒径和形貌特征;通过MTT法检测Thermosome蛋白组装体的细胞相容性.结果SDS-PAGE结果显示,Thermosome的α和β亚基以可溶性蛋白在BL21大肠杆菌中表达,凝胶过滤层析得到了较高纯度的α和β亚基蛋白;动态光散射结果显示Thermosome蛋白组装体尺寸为20.2 nm,组装体在透射电镜下呈现中空球形结构;MTT结果显示Thermosome纳米粒处理后细胞存活率接近100%;绿色荧光标记的纳米粒能够被细胞摄取进入细胞内.结论本研究成功表达纯化Thermosome的α和β亚基蛋白,得到平均粒径在20.2 nm的中空笼状自组装纳米颗粒;Thermosome蛋白纳米颗粒具有良好生物相容性,能够被肿瘤细胞高效摄取.

乳腺癌细胞来源的细胞膜纳米囊泡制备及靶向特性

目的制备乳腺癌细胞来源的细胞膜纳米囊泡(NVs),探讨其基本特性、肿瘤细胞内吞,在荷瘤小鼠模型中的体内分布,探究其肿瘤靶向特性。方法体外培养乳腺癌4T1细胞,通过超速离心法提取细胞膜,利用脂质体挤出仪制备细胞膜纳米囊泡。应用动态光散射方法检测囊泡粒径分布,利用透射电子显微镜研究囊泡的形貌特征。通过检测囊泡在磷酸盐缓冲液中的粒径变化分析囊泡的稳定性。应用CCK8法检测不同质量浓度(5、10、20、50和100 mg·L-1)囊泡处理后树突细胞的存活率。荧光显微镜成像检测囊泡在乳腺癌细胞中的内吞。建立皮下乳腺癌荷瘤小鼠模型,将Cy5.5标记的囊泡经尾静脉注射后通过小动物活体成像系统分析其体内分布。结果制备了乳腺癌细胞4T1来源的囊泡,平均粒径为123.2 nm,在透射电镜下呈现为空心的圆球形结构。囊泡在磷酸盐缓冲液中孵育7 d后粒径无明显变化。CCK8结果显示不同囊泡浓度处理后树突细胞存活率均大于90%,荧光显微镜成像显示囊泡能被乳腺癌细胞摄取到细胞内,体内成像结果显示乳腺癌细胞来源的囊泡具有较正常细胞囊泡更高的肿瘤组织蓄积。结论成功制备出4T1细胞来源的NVs,该NVs能被乳腺癌细胞摄取,并展现良好的肿瘤靶向作用。