影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨

目的探讨影响大肠杆菌DH5a电转化效率的几个关键但易被忽略的因素。方法于室温(25℃)用空气浴振荡和水浴振荡培养大肠杆菌DH5a,用10%(V/V)甘油-水溶液和10%(V/V)甘油-生理盐水溶液冻存所制感受态细胞。在电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF的条件下进行电转化,电击冰浴(0～10min)后测定转化效率。结果于25℃水浴振荡培养细菌、10%甘油-生理盐水溶液冻存感受态细胞、电转化后冰浴6min,转化效率高达1.01×1010CFU/μg DNA。结论该法适合于大肠杆菌DH5a,可获得较高的转化效率。

柯萨奇病毒A16型快速纯化和中和性单克隆抗体制备与鉴定

目的建立柯萨奇病毒A16型快速纯化方法,制备中和性单抗,并对单抗进行分析。方法收获CA16培养上清液,超滤浓缩,氯化铯密度梯度离心纯化病毒颗粒,透射电镜鉴定纯化产物。福尔马林灭活CA16,免疫BALB/c小鼠,制备分泌抗CA16特异性单抗的杂交瘤细胞系,用ELISA和中和试验分别对单抗特性进行分析。结果初步建立CA16病毒氯化铯密度梯度纯化方法,电镜显示,病毒颗粒为二十面体立体对称球形结构,病毒直径在20-30nm间,大小均匀。获得2株分泌抗CA16单抗的杂交瘤细胞系,2株单抗均为IgG2a亚型,Anti/CA16/5效价为10^3,Anti/CA16/10效价为104。2株抗体的中和效价分别为1∶256和1∶1 024。结论初步建立氯化铯密度梯度纯化CA16的方法,筛选出2株具有中和活性的抗CA16单抗,为CA16病毒的基础研究提供重要的原材料。

肾综合征出血热自然感染和人工免疫后的抗体形成

目的调查‘肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）病毒自然感染，分析免疫接种后抗体变化规律，为调整出血热预防控制策略提供依据。方法采取分层整群抽样方法，在出血热高发病区、低发病区和非疫区共抽取600人，进行发病调查和血清IgG抗体酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测。结果既往出血热发病人群IgG水平〉高发区接种人群〉低发区接种人群〉高发区非发病非接种人群〉低发区非发病非接种人群；既往出血热病例的IgG水平每10年衰降25％，30年后仍是接种人群的2倍以上；高发病区汉坦病毒隐性感染率33％，低发病区隐性感染率为23％；完成基础免疫接种即可获得较高抗体水平，末次接种5—10年后抗体水平下降40％，10—20年下降60％。结论出血热显性感染可获得持久免疫力，在出血热历史疫区隐性感染率较高，出血热疫苗末次接种7—8年需再加强一针。

Red系统三种蛋白在哺乳动物细胞核中定位表达的设计和构建

目的:构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体。方法:通过给red基因(gam、bet和exo)的3,端分别加入由7个氨基(pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val)组成的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)和4个甘氨酸构成的linker序列,再从λ噬菌体基因组中,通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列,将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到含3个目的基因(gam-NLS、bet-NLs和exo-NLS)的三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN,转染培养的哺乳类细胞后,用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测,观察蛋白的定位情况。结果:不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核;而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后,均表达定位于细胞核中。结论:三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础。

狗肾细胞、人喉表皮癌细胞、横纹肌肉瘤细胞混合培养检测呼吸道病毒和肠道病毒

目的培养狗肾细胞(MDCK)、人喉表皮癌细胞(HEP-2)、横纹肌肉瘤细胞(RD)混合细胞系(MHR),为检测呼吸道病毒和肠道病毒建立新方法。方法将生长成片的MDCK、HEP-2、RD细胞按照1∶1∶1的比例混合,将甲型H1N1、H3N2、Victoria、Yamagata 4种亚型的流感病毒进行101~1010倍稀释,接种到MHR和MDCK中,在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取培养物上清测血凝(HA)滴度;将肠道病毒Cox A16分别接种到MHR和RD、HEP-2细胞中。结果甲型H1N1、H3N2、Victoria、Yamagata 4种亚型流感病毒在MDCK细胞的血凝滴度高于或等于混合细胞,能检测到的最低浓度高于混合细胞,Cox A16病毒在3种细胞出现CPE的时间长短为RD<MHR<HEP-2。结论 MHR对流感病毒和肠道Cox A16病毒均较敏感,可用于流感病毒和肠道病毒的分离培养。