马铃薯病毒一步法RT-PCR诊断研究

运用一步法RT-PCR对马铃薯和烟草中的马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒进行了检测,实验表明:对酚-SDS方法提取的病毒核酸进行扩增,一步法RT-PCR检测到的扩增产物的灵敏度较两步法RT-PCR的高100倍左右.两种提取方法对比,用一步法RT-PCR进行扩增,检测到的PEG法扩增产物的灵敏度较酚-SDS法扩增产物的灵敏度高3倍.建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的马铃薯病毒一步法RT-PCR检测技术.

中国番茄黄化曲叶病毒双向启动子的鉴定

以中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10分离物感染的烟草植物总DNA为模板,扩增病毒双向启动子片段,并分别以不同方向与gus基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.用土壤杆菌介导的方法将质粒载体导入本氏烟叶片细胞和植株茎部进行瞬时表达结果表明,互补链和病毒链启动子均能驱动gus基因表达,并且互补链启动子的活性高于病毒链启动子的活性. TYLCCNV伴随的卫星DNAβ分子的βC1的表达载体与启动子载体进行瞬时共表达时,βC1对病毒链和互补链启动子的活性均没有调节作用.

白癜风患者LFA-1、ICAM-1的检测及其与移植疗效的相关性研究

目的探讨白癜风自体表皮移植疗效与LFA-1、ICAM-1的相关性。方法对20例稳定期白癜风患者进行负压吸疱移植治疗并收集白斑及非白斑区的疱液,用ELISA方法测定组织液中LFA-1、ICAM-1的水平。移植后1个月观察疗效。结果 20例白癜风患者局部白斑区与非白斑区组织液ICAM-1、LFA-1水平相比,具有统计学差异。14例寻常型白癜风患者局部白斑与非白斑区组织液ICAM-1、LFA-1水平比较具有统计学差异。6例节段型白癜风患者白斑与非白斑区组织液ICAM-1、LFA-1水平比较无统计学差异。移植失败组白斑区ICAM-1的浓度明显高于成功组(P<0.05),非白斑区ICAM-1的浓度比较则无统计学意义。两组之间LFA-1的浓度比较无统计学意义。结论 LFA-1及其配体ICAM-1的异常表达对白癜风患者皮损区的微环境改变有一定的影响,可能与自体表皮移植疗效相关。

InnVit基因沉默对黑素细胞B10BR黑素合成和细胞凋亡的影响

目的观察siRNA抑制InnVit基因后对小鼠永生化B10BR黑素细胞黑素合成和细胞凋亡的影响,进一步探讨InnVit基因的生物学功能。方法将InnVit基因的三对siRNA转染B10BR黑素细胞,半定量RT-PCR检测InnVit基因抑制后对黑素细胞InnVit基因mRNA水平的变化;采用MTT法测定InnVit基因抑制后对细胞增殖率的影响;采用流式细胞仪检测InnVit基因抑制后对黑素细胞凋亡的影响。结果siRNA1转染后,InnVit基因在黑素细胞中的表达明显下降,试验组细胞的早期凋亡率(35.80%)较对照组(6.47%)明显增加。结论通过RNA干扰技术可抑制InnVit在黑素细胞中的表达,可诱导B10BR细胞的凋亡增加。

单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立

目的建立实时荧光PCR定量检测单纯疱疹病毒2型(HSV2)ICP4基因的方法。方法依据HSV2ICP4基因序列设计引物,PCR纯化后克隆到pMD-18T载体上进行测序,抽提重组质粒作为标准品。根据测序结果设计荧光定量PCR的引物和探针,质粒标准品10倍稀释后进行扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度和可靠性分析。结果测序结果显示在扩增的PCR片段中有在A-G无和T-C的无义突变。标准品101以下没有检测信号,101具有明确的检测信号,因而检测的灵敏度为10。可靠性测定结果:107～101进行10次重复Ct值的平均值分别为14.275±0.137、17.988±0.162、22.081±0.259、25.957±0.345、29.565±0.203、33.269±0.287、37.737±0.698,变异系数分别为0.965%、0.902%、1.174%、1.329%、0.686%、0.862%、1.851%。Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系。回归系数为0.998。结论成功建立了HSV2ICP4基因实时定量荧光PCR检测的方法,灵敏度高,重复性好,可用于HSV2ICP4基因的定量分析。

InnVit基因对永生化黑素细胞B10BR迁移的影响

目的分析InnVit基因对永生化黑素细胞B10BR迁移的影响,探讨InnVit基因对黑素细胞生物学功能的调控情况。方法化学合成InnVit基因特异性SiRNA,构建InnVit基因表达载体P3XF-P120,lipofectamineTM2000转染B10BR细胞。半定量RT-PCR鉴定抑制和过表达效率;Transwell观察InnVit基因抑制和过表达后黑素细胞的迁移能力,明胶酶谱分析MMP2和MMP9的活性。结果成功在永生化黑素细胞B10BR中抑制和过表达InnVit基因。细胞处理20h后,抑制和过表达组Transwell滤膜下层黏附细胞数与对照组相比无显著性差异(P>0.05),MMP2和MMP9活性较对照组也无显著性差异(P>0.05)。结论InnVit基因对黑素细胞的迁移无明显调控作用。

高层民用建筑防排烟设计中排烟口设置的探讨

针对排烟口在高层民用建筑防排烟设计中的重要地位,阐述了自然排烟系统中可开启外窗面积的要求、自然排烟的设置位置的要求以及需注意的问题,论述了需要机械排烟系统的设置部位及设置排烟口的一般规定,以供防排烟的设计人员参考。

函数图象在解题中的应用

函数图象教学在中学数学中占有很大比重,它包括两个层次的要求,一是能准确绘出已知函数的图象或能根据图象得出函数基本性质;二是能够应用函数图象来解决实际问题,一般来说,前者较易掌握,而后者却难度较大,常常会使学生面对问题,困难重重,无从下手。其主要原因除学生对函数概念缺乏整体意识外,更多的是因教材安排这类题型较少,学生对函数图象在解题中的具体运用途径了解不多,影响了解题思路的形成,造成被动局面。为此,就函数图象在解有关方程、不等式问题及处理极值问题时的具体应用,谈一谈这方面的应用。

数学概念教学五步谈

教学概念是现实世界中空间形式和数量关系及其特有属性在思维中的反映。正确理解并牢固掌握教学概念,是学好教学的前提。如果学生对所学概念能深刻理解、准确把握、正确使用其名称和符号,并能在运算、推理中熟练运用,那么对数学公式定理的学习,对数学思维方式的养成都将起到一个积极的促进作用。反之,就很难学好数学。数学概念的教学目的是:理解、巩固、运用。怎样才能达到这一目的呢?需要从五个方面考虑:

脑出血恢复期患者自我超越水平现状及影响因素研究

目的调查脑出血恢复期患者自我超越水平并分析其影响因素。方法2019年2月—10月,采用一般资料问卷、自我超越量表、Mishel疾病不确定感量表及简易应对方式量表对广东省某三级甲等医院就诊的146例脑出血恢复期患者进行问卷调查。结果脑出血恢复期患者自我超越得分为(36.97±5.07)分;多元线性回归分析显示,文化程度、日常生活自理程度、疾病不确定感、积极应对是脑出血恢复期患者自我超越的影响因素,可解释总变异的50.5%。结论脑出血恢复期患者自我超越水平较差,医务人员应根据患者自我超越水平的影响因素实施个体化干预,从而提高患者的自我超越水平。

ADOPT模式在脑出血患者术后早期康复中的应用

目的:探讨应用ADOPT模式对脑出血患者术后早期康复效果的影响。方法:选择脑出血患者99例,随机分成观察组50例和对照组49例。对照组实施常规术后早期康复护理,观察组在此基础上应用ADOPT模式进行康复指导。出院前评估两组患者的康复锻炼知识、锻炼依从性和肢体运动功能。结果:出院前观察组患者的康复锻炼知识掌握度、锻炼依从性均优于对照组,观察组肢体运动功能得分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:基于ADOPT模式的护理指导能够帮助脑出血患者更好地掌握康复锻炼知识,提高锻炼依从性,进而促进肢体功能康复。

白癜风患者皮损处核因子E2p45相关因子2核转位异常

目的明确白癜风患者皮损处是否存在核因子E2p45相关因子2（Nrf2）核转位异常。方法应用试剂盒检测8例表皮移植白癜风患者皮损处与正常供皮处疱液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和过氧化氢酶（CAT）水平，采用细胞免疫荧光组化法鉴定8例寻常型白癜风患者皮损处与正常供皮处表皮细胞以及3例健康对照包皮原代培养的表皮细胞中Nrf2的表达，同时应用蛋白质印迹法检测上述样本中表皮细胞的胞质和胞核中Nrf2的表达水平。结果皮损处SOD与CAT水平显著低于正常供皮处（P〈0．05），MDA水平显著高于正常供皮处（P〈0．05）；细胞免疫荧光结果显示，健康对照、患者正常供皮处Nrf2在表皮细胞的胞质和胞核中均有表达，而患者皮损处Nrf2表达主要集中在胞质，胞核中表达量非常低。蛋白质印迹结果显示，核蛋白中Nrf2表达水平，白癜风患者皮损处（0．11±0．03）明显低于正常供皮处（0．27±0．06）和健康对照（0．32±0．02，均P〈0．01）；胞质蛋白Nrf2表达水平，皮损处（0．63±0．04）与正常供皮处（0．61±0．03）和健康对照（0．65±0．04）差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论白癜风患者皮损处表皮细胞存在Nrf2核转位异常。

人酪氨酸酶抗原表位肽的表达、纯化及在白癜风患者中的抗原性检测

目的表达人酪氨酸酶抗原表位肽,探讨其在白癜风患者自身抗体检测中的应用。方法目的基因合成后克隆至原核表达载体 pGEX-4T-2,转化大肠杆菌 BL21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和 Western 印迹鉴定目的蛋白表达,以此蛋白为抗原,检测100例进展期白癜风患者和30名正常人血清 IgG 抗体情况。结果成功构建重组表达载体,重组蛋白成功表达。应用凝胶分析系统分析蛋白表达量发现,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的70%。融合蛋白经过谷胱苷肽 S-转移酶试剂盒纯化后,其蛋白纯度达90%以上。100例白癜风患者中64例血清与目的蛋白结合反应呈阳性,30名正常人血清结合反应均呈阴性。结论成功表达了人酪氨酸酶抗原表位肽,其在白癜风患者血清中具有抗原性。

三种表达肽检测进展期白癜风患者血清酪氨酸酶抗体的比较

目的应用三种表达肽TYR240—300，TYR240—479和TYR检测进展期白癜风患者血清酪氨酸酶IgG抗体，比较三者的抗体检测差异，筛选优势抗原。方法原核表达、纯化三种表达肽TYR240—300，TYR240—479和TYR，Western印迹鉴定纯化蛋白；以纯化的三种表达肽作为抗原，以提取的黑素细胞总蛋白作为阻断抗原，进行阻断ELISA分析；以纯化的三种表达肽作为抗原，检测100例进展期白癜风患者血清中酪氨酸酶IgG抗体，比较三种表达肽的抗体检测阳性率及滴度差异。结果三种表达肽均能被天然的黑素细胞抗原所阻断，100例进展期白癜风患者血清中，抗TYR240—300IgG抗体与抗TYR240—479IgG抗体阳性率分别为32．0％和62．0％，不同型别患者两种抗体检出阳性率差异较大，泛发性（8例）分别为4例和7例，局限性（8例）分别为3例和4例，散在性（48例）分别为31．3％和60．4％，肢端性（19例）分别为20．0％和52．6％，节段型（17例）分别为47．1％和82．4％。40例进展期白癜风患者血清中抗TYR240—479IgG抗体与抗TYRIgG抗体的阳性率相近，分别为62．5％和60．0％。表达肽TYR240—479和TYR检测的进展期白癜风患者血清中IgG抗体最高滴度均为1：320，而表达肽TYR240—300检测的进展期白癜风患者血清中IgG抗体最高滴度均为1：160。结论TYR240—479是用于白癜风患者中酪氨酸酶抗体检测的优势抗原。

白癜风患者皮损NF—E2相关因子2的表达

目的分析白癜风患者皮损处Nrf 2表达水平。方法采用AEC免疫组化法检测4例表皮移植的寻常型白癜风患者皮损处Nrf 2的表达，蛋白印迹分析表皮移植的8例寻常型白癜风患者皮损组织和其正常供皮处组织细胞核和细胞质中Nrf 2的表达水平，并进行统计学差异分析。结果与白癜风患者正常供皮处组织相比，皮损处Nrf 2的表达多数集中在角质形成细胞的胞质中，细胞核中表达量非常低。蛋白印迹结果表明，白癜风患者皮损处核蛋白中Nrf 2表达水平（0．10±0．03）显著低于正常部位（0．26±0．03，P〈0．01），胞质蛋白中皮损处Nrf 2表达水平（0．61±0．03）与正常部位（0．60±0．02）差异无统计学意义（P〉0．05）。结论白癜风患者皮损处存在Nrf 2核转位异常。

InnVit／FBXO11在白癜风中的表达及其对酪氨酸酶输出内质网的影响

目的通过检测InnVit（即FBXO11）在白癜风患者中的表达及其对内质网形态和酪氨酸酶输出内质网的影响，探讨InnVit基因对黑素细胞功能的影响。方法收集10例表皮片移植白癜风患者皮损区与正常供皮区组织，免疫组化检测InnVit蛋白的表达情况。化学合成InnVit基因特异性siRNA片段及构建过表达质粒载体P3XF-P120，npofectamine^TM 2000脂质体方法转染B10Br细胞，电镜观察不同处理组细胞的内质网形态变化；激光共聚焦显微镜观察酪氨酸酶蛋白及钙网蛋白在内质网中的共定位情况；Western印迹检测转染细胞中InnVit蛋白、酪氨酸酶及钙网蛋白的表达水平。结果10例白癜风患者皮损区InnVit蛋白表达明显低于正常供皮区。未处理组与质粒转染组的黑素细胞内质网形态正常，而siRNA转染组的细胞内质网有明显膨胀，且其相对膨胀率（1．97±0．48）与未处理组（1．28±0．09，P=0．001）和质粒转染组间（1．24±0．13，P=0．001）比较，差异均有统计学意义。未处理组与质粒转染组细胞中酪氨酸酶的表达范围部分地超出了钙网蛋白的标记范围，而siRNA转染组细胞中酪氨酸酶几乎与钙网蛋白共定位于内质网中。siRNA转染组InnVit蛋白的相对表达量（0．030±0．004）低于未处理组（0．320±0．020）和质粒转染组（0．710±0．040），质粒转染组高于未处理组（均P〈0．01）；钙网蛋白3组间差异无统计学意义（P〉0．05）；siRNA转染组酪氨酸酶（1．040±0．060）高于质粒转染组（0．720±0．030）和未处理组（0．350±0．030），质粒转染组高于未处理组（均P〈0．01）。结论白癜风患者皮损区InnVit蛋白表达下降；InnVit基因的表达影响了黑素细胞内质网的形态，并可以调控酪氨酸酶在内质网中的输出，进而影响黑素细胞的功能。

人酪氨酸酶抗原表位肽的表达、纯化及生物学活性分析

目的 探讨人酪氨酸酶抗原表位肽在白癜风患者自身抗体检测中的表达。方法 目的基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，通过SDS-PAGE分析和蛋白质印迹鉴定目的蛋白表达，ELISA检测其生物学活性。结果 成功构建重组表达载体，SDS-PAGE和蛋白质印迹结果表明，重组蛋白成功表达。应用凝胶分析系统分析蛋白表达量发现，目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的90％。融合蛋白经过试剂盒纯化后，其蛋白纯度达95％以上。ELISA检测纯化蛋白的生物学活性，结果表明，纯化蛋白具有结合白癜风患者IgG的能力。结论 成功表达了人酪氨酸酶抗原表位肽，其表达蛋白具有生物学活性。

人黑素浓集素受体1抗原表位肽的表达、纯化及其在白癜风患者中的检测

目的 表达及纯化人黑素浓集素受体1抗原表位肽,探讨其在白癜风患者自身抗体检测中的应用.方法 人黑素浓集素受体1抗原表位肽编码基因合成后克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和Western印迹鉴定目的 蛋白表达.以提取的黑素细胞膜蛋白作为阻断抗原,进行阻断ELISA分析.以目的 蛋白为抗原,检测100例进展期白癜风患者和30例正常人血清IgG抗体情况.结果 成功构建重组表达载体,重组蛋白成功表达并纯化,上样量低于0.0625μg时纯化率达100%.目的 蛋白与白癜风患者血清IgG抗体间的结合能被天然黑素细胞膜抗原抑制.100例进展期白癜风患者血清中有36例与目的蛋白结合反应呈阳性.结论 成功表达并纯化了人黑素浓集素受体1抗原表位肽,该目的蛋白能够结合白癜风患者血清中IgG抗体,可以用于抗人黑素浓集素受体1抗体的检测.

槲皮素对鼠黑素细胞株BIOBR细胞的抗氧化保护效应及对其生物学活性的影响

目的探讨槲皮素保护鼠永生化黑素细胞（B10BR）对抗氧化应激的有效性及其对B10BR细胞生物学活性影响。方法MTT法测定BIOBR细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，倒置显微镜下观察细胞形态改变．并检测槲皮素对酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。结果经33．33μmol／L槲皮素预处理24h后细胞活性增高至（94．22±3．36）％，此外黑素细胞的酪氨酸酶活性及黑素含量可分别增高至（107．15±10．96）％和（111．85±9．49）％，与过氧化氢处理组相比，差异均有统计学意义（P〈0．01）。流式细胞仪检测结果表明，槲皮素可抑制过氧化氢诱导的黑素细胞凋亡。结论槲皮素抑制过氧化氢诱导黑素细胞凋亡的保护效应为其治疗白癜风提供一定的依据。

白癜风进展相关危险因素分析

目的 探讨白癜风进展相关的可能危险因素.方法 采用问卷调查方式获得1088例白癜风患者的临床资料,对同病程白癜风患者进展的可能诱因与皮损面积的相关性进行统计分析,有无诱因的二组间患者的比较采用平均受累面积指数的配对t检验.结果 有家族史与无家族史患者组间平均受累面积指数差异无统计学意义（t=1.499,P＞0.05）;有同形反应与无同形反应患者组的平均受累面积指数差异有统计学意义（t=6.770,P＜0.01）,且有同形反应患者组平均受累面积指数更高;伴精神因素与无精神因素影响的患者组间平均受累面积指数差异有统计学意义（t=6.704,P＜0.01）.结论 有精神因素影响或同形反应的患者白斑进展较快.