耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CHIPS基因的克隆、序列分析及原核表达

目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)趋化抑制蛋白(CHIPS)进行扩增、克隆、序列分析、原核表达及纯化,为后续的疫苗研究奠定基础。方法根据GenBank中趋化抑制蛋白(CHIPS)的序列,设计一对特异性引物,以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增CHIPS基因,纯化DNA进行EcoRI、XhoI双酶切鉴定及测序鉴定,并将CHIPS亚克隆入表达载体PET-28α,转化感受态大肠杆菌BL21,对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导表达重组蛋白,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证重组蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌临床儿童分离株基因组为模板,成功扩增CHIPS基因,基因大小为450bp;重组PET-28a(+)-CHIPS双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示CHIPS在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.98%。经IPTG诱导后,pET-28a(+)-CHIPS/BL21在相应分子量(17kDa)可见融合蛋白在上清表达,免疫印迹检测到目的蛋白。结论成功从儿童分离株MRSA中构建了CHIPS的原核表达系统,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为后续的疫苗研究奠定基础。

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的:从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础。方法:根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析。结果:以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2%,IPTG诱导后,pGEX-4T-1-NAP/BL21在相应分子量(42.8 kD)可见融合蛋白的表达。幽门螺杆菌儿童分离株GZCHl NAP序列已登录GenBank(登录号:GU301881)。结论:从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础。

嗜麦芽窄食单胞菌Smqnr耐药基因的序列分析及原核表达

目的:对嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株gzch770(SMgzch770)携带的喹诺酮耐药基因Smqnr进行扩增、测序及原核表达,为研究Smqnr蛋白的功能奠定基础。方法:提取SMgzch770基因组染色体,PCR扩增Smqnr全基因并克隆入pMD18-T载体进行核苷酸序列分析;将Smqnr基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况。结果:以染色体DNA为模板,成功扩增660bpSmqnr基因;序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%以上;SMgzch770Smqnr序列已登录GenBank(登录号:HQ315851);SDS-PAGE显示,融合基因表达的蛋白约为50kDa,其中Smqnr蛋白约为24kDa。结论:从SMgzch770中成功克隆及表达了Smqnr基因,为进一步进行Smqnr蛋白高级结构测定的结晶试验提供了必须材料。

幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达、纯化及免疫活性

目的:在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌临床分离株尿素酶B(UreB),纯化重组蛋白并分析其免疫活性。方法:将pGEX-4T-1-UreB重组菌BL21复舒,挑单菌落接种于含氨苄的LB培养基中,0.5mmoL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,使用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测血清抗体效价,并使用感染患者血清进行Western-blotting鉴定重组蛋白反应原性。结果:SDS-PAGE示在约87kD相应分子量可见融合蛋白表达,产物主要在表达上清以可溶形式存在,纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性IgG效价为1:51200,Westernblotting示重组蛋白能被幽门螺杆菌感染患者血清识别。结论:UreB在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有较好的免疫原性及反应原性。

嗜麦芽窄食单胞菌产氨基糖苷类修饰酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ的克隆与表达

目的对嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株gzch810(SM gzch810)携带的产氨基糖苷类修饰酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ进行扩增、测序及原核表达,为下一步功能试验的开展提供基础材料。方法提取SM gzch810基因组染色体,PCR扩增APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ全基因并克隆入pMD18-T载体进行核苷酸序列分析;将APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况。结果以染色体DNA为模板,成功扩增800bp APH(3′′)-Ⅰ基因和550bp AAC(2′)-Ⅰ基因;序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性分别达91%及95%;SM gzch810APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ序列已登录GenBank(登录号:HQ315852和HQ315853);SDS-PAGE显示,融合基因表达的蛋白相对分子质量分别约为56×103和46×103。结论从SM gzch810中成功克隆及表达了APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因,为下一步检测上述两种重组体大肠杆菌对相应抗菌药物的耐药性及其功能评价做好准备。

C反应蛋白和血常规中白细胞计数联合检验在儿科中的应用价值分析

目的观察分析C反应蛋白和血常规中白细胞计数联合检验在儿科中的应用价值。方法选取250例门诊儿科病例,所有患儿均接受C反应蛋白和血常规中白细胞计数单独检验及联合检验。分析比较不同感染患儿的C反应蛋白水平、白细胞计数以及C反应蛋白阳性率、白细胞计数阳性率、联合检测阳性率。结果 250例患儿中, 180例细菌感染,占72.00%;70例病毒感染,占28.00%。细菌感染患儿的C反应蛋白、白细胞计数分别为(25.02±13.25)mg/L、(15.01±2.60)×109/L,显著高于病毒感染患儿的(15.52±6.88)mg/L、(8.19±1.48)×109/L,差异具有统计学意义(P<0.05);细菌感染患儿的C反应蛋白阳性率、白细胞计数阳性率分别为95.56%(172/180)、83.33%(150/180),均显著高于病毒感染患儿的38.57%(27/70)、40.00%(28/70),差异具有统计学意义(P<0.05)。250例患儿C反应蛋白检验和白细胞计数检验的阳性率分别为79.60%(199/250)、71.20%(178/250), C反应蛋白、白细胞计数联合检验的阳性率为97.60%(244/250), C反应蛋白、白细胞计数联合检验阳性率显著高于C反应蛋白检验和白细胞计数检验,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 C反应蛋白和血常规中白细胞计数联合检验在儿科中的应用价值比较高。

广州地区幽门螺杆菌儿童分离株空泡毒素基因A的分型

目的探讨广州地区幽门螺杆菌(Hp)儿童分离株空泡毒素基因A(vacA)基因亚型的分布。方法从胃十二指肠疾病患儿胃黏膜标本中分离培养Hp,PCR法测定vacA的m1、m2、s1、s2基因亚型。结果从儿童胃黏膜标本中成功分离出106株Hp,106株中vacA基因m阳性率为94.34%(100/106),阴性率为5.66%(6/106)。m1阳性率为36.00%(36/100),m2阳性率为64.00%(64/100)。s阳性率为96.23%(102/106),阴性率为3.77%(4/106),基因分析显示均为s1。vacA亚型组合s1/m1阳性率为36.73%,s1/m2组合阳性率为63.27%。结论广州地区Hp儿童分离株vacA的优势基因型为vacAs1、vacAm2、vacAs1/m2。

研究早孕期全面筛查甲状腺功能对改善妊娠结局的意义

目的研究早孕期全面筛查甲状腺功能对改善妊娠结局的意义。方法 200例接受甲状腺功能全面筛查的早期孕妇,根据游离甲状腺素(FT4)和促甲状腺激素(TSH)两项筛查指标水平不同分为A组(指标异常,98例)和B组(指标正常,102例);A组孕妇根据甲状腺疾病类型不同分成Ⅰ组(甲状腺病症,36例)、Ⅱ组(甲状腺相关病症,20例)、Ⅲ组(具有甲状腺病症既往病史,42例)。观察并比较不同组别孕妇的甲状腺功能筛查情况及妊娠结局情况。结果 A组孕妇甲状腺功能亢进症(甲亢)异常率、甲状腺功能减退症(甲减)异常率、甲状腺功能异常率、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)阳性率均明显高于B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ组甲亢异常率明显低于Ⅰ组,差异具有统计学意义(P<0.05);Ⅱ组甲状腺功能正常率明显高于Ⅰ组和Ⅲ组,Ⅲ组甲状腺功能异常率明显低于Ⅰ组,差异具有统计学意义(P<0.05)。A组发生胎儿窘迫9例、早产8例、产后出血10例、胎盘早剥7例及子痫前期8例;B组发生胎儿窘迫2例、早产1例、产后出血3例、胎盘早剥1例及子痫前期1例;A组各不良妊娠结局发生例数均明显多于B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论安排早期孕妇进行甲状腺功能全面筛查能够确定孕妇身体状况,对孕妇的妊娠结局予以预测,对于改善孕妇妊娠结局具有重要作用。

甲状腺功能指标与糖尿病指标监测对孕妇妊娠结局的影响研究

目的:探讨甲状腺功能与糖尿病功能指标水平对孕妇妊娠结局的影响。方法:2017年11月-2019年4月收治妊娠糖尿病合并亚临床甲状腺功能减退症孕妇60例,随机分为两组,各30例。常规组采取常规治疗;研究组在常规治疗基础上进行甲状腺功能以及糖尿病功能指标水平监测,并制定/调整饮食治疗以及降糖、治疗甲减的用药方案。比较两组妊娠并发症发生率和妊娠结局情况,统计两组孕妇妊娠后新生儿情况。结果:研究组妊娠并发症发生率显著低于常规组,差异有统计学意义(P<0.05);研究组孕妇妊娠结局明显优于常规组,差异有统计学意义(P<0.05);研究组孕妇妊娠后新生儿平均孕周、新生儿5 min Apgar评分、新生儿体重均显著优于常规组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:实施甲状腺功能及糖尿病功能指标水平监测,并根据相关指标变化制定与调整饮食治疗方案以及降糖、治疗甲减用药方案,能够有效降低孕妇妊娠并发症的发生,改善妊娠结局,提高新生儿Apgar评分,有利于保障母婴安全。

肠道病毒71型VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的对肠道病毒71型VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据GenBank中EV71序列设计一对特异性引物,以EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板,RT-PCR扩增EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体pET28a。构建pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,使用SDS-PAGE及Western blot分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用ELISA分别检测EV71阳性与COX A16阳性患者VP-1IgG抗体,进行统计学分析。结果目的基因经BLAST比对,同源性与GenBank登录号为JQ766207.1 EV71 VP1一致性达99%。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×103,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA结果显示EV71阳性患者OD值为(2.425±0.521),COX A16阳性患者OD值为(1.205±0.314),健康对照组OD值为(0.353±0.128)。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84%和88%。结论成功构建了pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行ELISA初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于EV71诊断及疫苗的相关研究。

红细胞参数在孕检人员筛查地中海贫血的应用分析

目的探析红细胞参数在孕检人员筛查地中海贫血的应用价值。方法选取2015年6月~2017年6月到我院接受孕检的300例孕检人员为主要研究对象,采用全自动血液分析仪对孕检人员的红细胞参数进行测定,分析其地中海贫血基因,对孕检人员的各项红细胞参数检测结果以及最终的筛查诊断结果进行回顾性分析。结果 300例孕检人员中,地中海贫血检测阳性165例(观察组),地中海贫血检测阴性135例(对照组)。观察组研究对象的红细胞平均体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)均明显低于对照组,观察组的红细胞分布宽度变异系数(RDW-CV)高于对照组,两组之间的红细胞参数检测值比较差异有统计学意义(P<0.05)。红细胞参数检测和基因诊断在地中海贫血与非地中海贫血研究对象上的诊断准确率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论在孕检时采用检测红细胞参数的方式筛查地中海贫血,是一种经济、有效的筛查方法,可根据各项红细胞参数值判断是否患有地中海贫血,提升孕检效率。

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。

表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白枯草芽孢的免疫原性

目的 构建表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（NAP）的重组枯草芽孢,并鉴定其免疫原性.方法 以构建的pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,采用特异性引物扩增幽门螺杆菌NAP基因,与构建的以枯草芽孢外衣蛋白Cotc融合表达的质粒Pus186-Cotc连接,转化枯草杆菌WB600,提取质粒进行酶切、测序鉴定.应用营养耗竭法诱导枯草芽孢生成,提取重组芽孢外衣蛋白进行电泳及免疫印迹分析,并使用NAP特异性抗体免疫荧光检测芽孢表面重组蛋白的表达.以普通芽孢作为对照组,使用表面表达NAP的重组枯草芽孢口服免疫小鼠,ELISA法检测小鼠免疫后0、15、30、45 d的NAP特异性血清IgG水平,判断重组芽孢免疫原性.结果 以pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,扩增了NAP基因,并成功克隆入Pus 186-Cotc质粒,重组Pus 186-Cotc-NAP双酶切鉴定可见435 bp目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中.营养耗竭法可诱导重组枯草芽孢生成,产量达1×10^11/L,提取芽孢外衣蛋白电泳见相对分子质量25 600的目的条带.免疫印迹显示使用NAP特异性抗体在相应相对分子质量25 600可见识别带.并且使用NAP特异性抗体可检测到重组芽孢免疫荧光,表明NAP在芽孢表面成功表达.与对照组相比,NAP重组芽孢口服免疫小鼠15d后,NAP特异性IgG升高即达高峰,30、45 d后一直维持在高峰平台期（均P＜0.05）,表明重组芽孢具免疫原性.结论 成功构建了表面表达NAP的枯草芽孢工程菌,重组芽孢口服免疫小鼠具免疫原性,为幽门螺杆菌枯草芽孢疫苗的研制提供了依据.

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ldh-1基因的序列分析及原核表达

目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株携带的ldh-1基因进行克隆、表达,为L-乳酸脱氢酶(L-LDH)功能研究奠定基础。方法根据金黄色葡萄球菌Newman菌株的基因序列,设计一对特异性引物,以MRSA临床分离株(菌株号:1758)DNA为模板PCR扩增ldh-1,纯化DNA进行BamH I、Xhol I双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。诱导表达后的重组菌经超声破碎离心后,使用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。结果成功构建重组表达质粒pET-28a-ldh1,基因测序结果显示,扩增的ldh1基因全长956 bp,与金黄色葡萄球菌Mu50株ldh1基因的序列同源性为100%。IPTG诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳在39×103Mr处见目的条带,Western blot验证了重组蛋白L-LDH的表达。该蛋白呈可溶性表达,纯化后获得0.5 g/L的重组蛋白。结论在MRSA(菌株号:1758)临床分离株中成功克隆及表达了ldh-1基因,获得了纯化的重组蛋白,为进一步进行L-LDH的功能研究奠定了基础。

2010年广州某医疗中心儿童夏季细菌性腹泻的病原学调查

目的研究广州地区小儿夏季细菌性腹泻的病原菌分布。方法采集2010年5～7月广州市妇女儿童医疗中心珠江新城院区腹泻患儿的大便标本进行常规病原菌的分离培养,通过生化反应和血清凝集试验进行鉴定和分型,并使用金标法对空肠弯曲菌抗原进行检测。结果从110份标本中检出44株病原菌,检出率为40.0%。其中致病性大肠埃希菌17株,2岁以下患儿检出15株;空肠弯曲菌12株,2岁以下患儿检出10株;沙门菌6株;念珠菌纯生长6株;产气荚膜杆菌3株。结论广州地区夏季儿童细菌性腹泻的主要病原菌是致病性大肠埃希菌及空肠弯曲菌,两者的易感人群以2岁以下婴幼儿为主。