鸡Mx蛋白抗病毒作用研究进展

Mx蛋白是在脊椎动物机体细胞受病毒感染或诱生剂处理时由Ⅰ型干扰素诱导表达的一种抗病毒蛋白。Mx蛋白具有良好的抗病毒能力,靶向许多RNA病毒,诸如流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒等,对某些DNA病毒,例如乙型肝炎病毒也有一定的作用。近年来,基于鸡的Mx蛋白抗病毒作用及机制的相关研究逐渐增多,取得了一些进展。论文就近年来鸡Mx蛋白的抗病毒机制与分子生物学特点进行综述,针对鸡Mx蛋白在抗病毒与品种鸡抗病育种筛选等应用前景进行分析与探讨。

广西黄鸡β-防御素基因的克隆、序列分析与组织分布

用设计的特异性引物，采用RT-PCR方法扩增到广西黄鸡β-防御素基因gallinacin-1（简称Gal-1）-gallinacin-13（简称Gal-13）．通过克隆、测序获得这13个基因的cDNA核苷酸序列，并提交到GenBank（Gal-1-Gal-13基因的注册号为：DQ858297-DQ858310）．比较分析广西黄鸡13种β-防御素Gal-1～Gal-13基因分别与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的相似性，其氨基酸的相似性均在95．5％～100％之间．利用DNAStar软件对所获得的13种广西黄鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果Gal-1与Gal-5、Gal-12、Gal-2在同一分支上，Gal-6、Gal-7、Gal-9、Gal-8在同一分支上，Gal-10、Gal-11、Gal-4在同一分支，Gal-13独自为一分支．同样用RT-PCR方法分析了广西黄鸡肛防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布，结果发现：Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-10的表达分布非常广泛，Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12、Gal-13的分布较少．

研究生免疫学课程教学改革与思考

免疫学是当前生命科学中一门富有活力并具备巨大发展潜力的学科。该学科具有高理论性、高技术、多边缘、多交叉的特点,是生命科学的重要分支之一。但本课程内容多,涉及面广,较为抽象,学生难于理解和记忆。作者在教学过程中做好充分的课前准备,将多种教学方法融合于教学实践中,旨在唤起学生对免疫学的学习兴趣,提高教学质量。

H1N1亚型猪流感病毒HA基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA基因进行了生物信息学分析。将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。诱导表达的HA融合蛋白分子质量约为94.0 ku,表达产物占菌体总蛋白的29.5%。经Western-blot分析证实可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,成功筛选到2株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体;ELISA结果表明,制备的SIV单克隆抗体ⅢF6A4C10与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性,为H1N1 SIV的鉴别诊断奠定了基础。

逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒

基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳的LAMP反应条件。扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视。同时用特异性内切酶HhaⅠ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率均达到100%。结果表明,本研究建立的RT-LAMP检测猪流感病毒方法,操作简单,灵敏度高,特异性强,是一种适用于现场诊断的检测技术。

赭曲毒素A对黄羽肉鸡生产性能的影响

7日龄健康无病、体重均匀的360只黄羽公雏鸡,随机分为3组,每组4个重复,每个重复30只。第Ⅰ组(对照组)饲喂基础日粮(<2μg/kg赭曲霉素(OTA));第Ⅱ组(OTA组)在对照组日粮的基础上添加OTA使总浓度达2mg/kg,不含任何霉菌毒素处理剂;第Ⅲ组(OTA+MPL组)在第Ⅱ组日粮的基础上每吨饲料添加2kg MPL(即2000mg/kg MPL)。试验期分3个阶段(7～21日龄;22～42日龄;43～56日龄),共计49d。对黄羽肉鸡的生长性能进行了测定,结果表明:2mg/kg OTA对黄羽肉鸡的平均日增重及平均日采食量有显著的抑制作用;各组间饲料转化率差异不显著。2000mg/kg的MPL可以明显缓解OTA对黄羽肉鸡生产性能的抑制作用。

禽抗微生物肽的结构、分布及活性研究进展

抗微生物肽是生物体产生的一种具有抗微生物活性的多肽,具有抵抗原生动物、真菌、病毒、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性,不易产生耐药性,有取代传统抗生素的发展趋势。众多学者对禽类抗微生物肽进行了大量的研究,从禽类中陆续分离到20多种新的抗微生物肽,主要综述了禽抗微生物肽的结构、分布及活性研究进展,为禽抗微生物肽的进一步探索研究奠定基础。

应用RT-PCR技术快速检测鸭Ⅰ型病毒性肝炎

根据Genbank收录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的VP1基因保守序列,设计合成特异性引物,建立了检测DHV-Ⅰ的RT-PCR方法,并确定了该方法的特异性与灵敏性;对DHV-Ⅰ分离毒株进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果,而作为阴性对照的常见4种鸭病病原如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、鹅副粘病毒均未成功扩增;对DHV-Ⅰ临床病料进行RT-PCR检测,检测结果与病毒分离结果一致。结果表明,建立的DHV-Ⅰ的RT-PCR技术具有快速、特异、灵敏的特点。

丝羽乌骨鸡β-防御素基因的克隆和序列分析

用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术特异性地扩增到丝羽乌骨鸡β-防御素基因Gal-1(Gallinacin-1),Gal-1(a)(Gallinacin-1(a)),Gal-2(Gallinacin-2),Gal-4(Gallinacin-4)～Gal-13(Gallinacin-13)基因共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,并提交到GenBank,丝羽乌骨鸡β-防御素Gal-1,Gal-1(a),Gal-2,Gal-4～Gal-13基因的登录号为:DQ677632￣DQ677644。将丝羽乌骨鸡13种β-防御素Gal-1～Gal-13基因分别与GenBank中收录的防御素基因比对分析,其氨基酸序列的相似性均在95.5%～100%之间。利用DNAStar软件对所获得的13种丝羽乌骨鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果Gal-1、5、12在同一分支上,Gal-1(a)、4、8在同一分支上,Gal-1、2、9在同一分支,Gal-6、7在同一分支,Gal-13独在一分支上。

不同H9N2亚型鸭流感病毒NS1基因克隆和功能进化分析(英文)

禽流感病毒（AIV）在高免疫压力情况下会发生变异而逃避免疫系统的监视。其NS1蛋白共有230个氨基酸，其中前73个氨基酸残基以二聚体形式存在，包含了所有RNA的结合活性。NS1的氨基端1—73位是mRNA的结合区，氨基端1—100位是双股RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的结合区。PKR抗病毒作用机制如下：病毒侵染宿主细胞时，在宿主干扰素的诱导下，双股RNA与PKR结合，同时真核翻译启动子α亚单位发生磷酸化，导致PKR的激活。激活的PKR能同时抑制宿主细胞和病毒mRNA的翻译，从而最终抑制入侵病毒在细胞中的有效繁殖和扩散。

不同H9N2亚型鸭流感病毒NS1基因克隆和功能进化分析

[目的]为进一步研究NS1蛋白在流感病毒跨宿主传播中的作用机制奠定基础。[方法]采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法,从广东不同地区的12~20日龄正常番鸭群中分离鉴定出多株H9亚型水禽禽流感病毒株,对其中4株分离于正常番鸭的禽流感病毒毒株A/duck/ZQ/303/2007（H9N2）（简称A3）、A/duck/FJ/301/2007（H9N2）（简称C1）、A/duck/NH/306/2007（H9N2）（简称D6）和A/duck/SS/402/2007（简称E2）和1株来源于病死番鸭的H9N2亚型鸭流感病毒A/duck/ZC/1/2007（H9N2）（简称L1）的NS1基因进行克隆测序,并与GenBank中收录的其他NS1序列进行比较,分析NS1基因的进化关系。[结果]4株分离于不同地区正常番鸭群的流感病毒株NS1基因与GenBank中注册的H9N2 AIVNS1基因核苷酸同源性为99%~100%,氨基酸同源性为95%~100%。而分离于病死鸭的流感病毒株与H9N2 AIVNS1基因核苷酸同源性为94%~97%,氨基酸同源性为93%~99%。遗传进化结果表明：分离于正常鸭群的4株流感病毒NS1基因独成一分支,而L1株与2003年的鸡源AY66473株亲缘关系最近。DNAstar软件分析表明：与L1、AF523514（鸭源）、AY664743（鸡源）、EF155262.1（鹌鹑）相比,A3、C1、D6、E2 4株正常鸭H9N2 AIV毒株的NS1基因核苷酸序列在21（R→Q）7、07、1（KE→EG）8、6（A→S）1、24（V→M）、225（S→N）位点处发生改变,NS1基因的双股RNA依赖性蛋白激酶（dsRNA-dependent protein kinase,PKR）结合区（1~100位氨基酸）39、70、71和86位氨基酸发生变化,导致NS1蛋白潜在的抗原决定簇及其特定区域位于蛋白表面的可能性发生明显变化。[结论]NS1蛋白PKR结合区氨基酸序列变化与病毒的致病性有一定关系。

3株鸭乙型肝炎病毒全基因组克隆与序列分析

对河南南阳、安徽亳州、湖北潜江三地鸭血清样本用PCR进行鸭乙型肝炎病毒(DHBV)检测,并从三地经检测为DHBV阳性的样本中各挑选1份进行DHBV全基因的扩增、克隆、测序及序列分析。结果显示,河南南阳、安徽亳州、湖北潜江三地的鸭乙型肝炎自然感染率分别为17.6%、13.6%、16.1%,差异不显著(P>0.05)。河南南阳、安徽亳州、湖北潜江3株DHBV基因组全长分别为3024、3027、3024bp,均含有编码P、S和C蛋白的3个开放阅读框。通过各开放阅读框氨基酸同源性比较,发现编码P蛋白的区域差异较大。全基因序列分析显示,3株DHBV核苷酸同源性为95.1%~97.4%,与选取的25株参考株同源性为90.3%~96.2%。遗传进化分析及P蛋白关键位点分析结果表明,3株均为类中国基因型,湖北潜江的DHBV毒株P蛋白3位-345位关键氨基酸残基位点与中国毒株基因型相同,在367位-771位关键氨基酸残基位点与西方毒株基因型相同,推测其产生了重组。结果表明,成功克隆了华中地区的3株鸭DHBV全基因序列,为DHBV的分子流行病学调查提供参考。

3株传染性支气管炎病毒蛋鸡源河南株的S1基因序列分析

为了解河南省致蛋鸡产蛋量下降的传染性支气管炎病毒(IBV)的流行特征,从河南南阳、信阳和安阳等市的发病鸡场中鉴定出3株IBV,分别命名为CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018,并应用RT-PCR技术对3个IBV分离株的S1基因进行扩增与序列分析。结果显示,3个IBV分离株S1基因全长都为1617nt,编码539aa,并且都属于基因型4/91(CHⅡ);CK/CH/HN/NY1206/2017株S1基因裂解位点为RRSRR,CK/CH/HN/XY911/2017株S1基因裂解位点为RRSRR,CK/CH/HN/AY119/2018株S1基因裂解位点为RRFRR;3个分离株间核苷酸序列及其推导的氨基酸序列具有较高同源性,与位于同一基因型的参考毒株间同源性较高,与我国使用的Mass型常规疫苗H120和H52株的核苷酸和氨基酸同源性最低,分别仅为78.3%~78.4%和74.8%~75.4%,与4/91(CHⅡ)型疫苗4/91株的核苷酸和氨基酸同源性较高,分别达到94.7%~99.3%和93.9%~98.1%。综上,河南省致蛋鸡产蛋量下降的IBV流行株基因型相对统一,使用4/91(CHⅡ)型疫苗应可提高蛋鸡抗IBV的效率。

猪流感病毒H1N1广东分离株HA基因的克隆与进化分析

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR,从广东不同地区猪场分离鉴定出8株H1N1亚型猪流感病毒（SIV）。用流感病毒血凝素（HA）基因通用引物扩增了8株病毒的血凝素（HA）基因,经克隆测序,HA基因全长1 757 bp,编码566个氨基酸。8个毒株的HA基因推导氨基酸序列分析表明,均含有8个潜在的N糖基化位点,且糖基化位点相同,其HA1、HA2之间切割位点序列为IPSIQSR↓G,从分子水平推论,此8株H1N1 SIV均属于非高致病性毒株。同源性分析表明,此8株病毒的氨基酸序列与经典SIV之间的同源性在92.3%~94.7%之间;与2009年甲型H1N1流感病毒同源性在80.4%~92.4%之间;与欧洲类禽SIV分离株同源性在80.4%~84.1%之间。进化关系表明,该8株SIV与A-swine-Shanghai-3-2005-H1N1同处一分支,与2009年甲型H1N1流感病毒和经典SIV分离株亲缘关系较近,与欧洲类禽SIV分离株亲缘关系较远。

鸡胸腺肽β4、β15基因的原核表达及其生物学活性测定

为获得具有生物学活性的鸡胸腺肽β4、β15,根据大肠杆菌密码子偏爱性,设计合成鸡胸腺肽Tβ4、Tβ15基因片段,采用重叠PCR获得完整的Tβ4、Tβ15基因,将其连接到pET-28a(+)载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定,应用镍柱亲和层析纯化蛋白质,采用E玫瑰花环试验测定其生物学活性。结果显示,成功构建大肠杆菌表达载体pET28a-Tβ4和pET28a-Tβ15,目的蛋白在大肠杆菌中大量可溶性表达,蛋白质分子量大小均为6kD,镍柱亲和层析获得了纯化的蛋白质。E玫瑰花环试验结果显示,重组Tβ4的活力为35.5%,Tβ15的活力为18.7%,均能够明显增强T淋巴细胞的活性。表明Tβ4和Tβ15基因得到成功表达和纯化,并具有良好的生物学活性。

±800kV直流同塔双回输电线路雾霾天气下电晕电场效应研究

考虑不同湿度和不同污染等级雾霾状况,结合起晕的湿度效应和悬浮微粒的荷电机理,采用有限元方法计算±800 k V同塔双回UHVDC输电线路的电晕电场效应,得到了雾霾天不同的线路排布方式和线路布局参数下的地面合成电场和离子流密度变化规律,并进行了相应机理分析。为分析雾霾对同塔双回UHVDC输电线路电晕电场特性影响以及考虑雾霾天的同塔双回UHVDC输电线路参数设计提供参考。

构建以“五统一”为核心的社会保险管控体系实践探索

市县公司一体化管理是一项十分复杂的系统工程,随着“三集五大”体系的深入发展和市县人员交流的迅速推进,建立市、县 一体化社会保险管控体系的需求日益迫切。对标时代发展新要求,国网泰安供电公司(以下简称“公司”)以市县一体化管控为目标,以“规 章制度、业务流程、信息管控、资金安全、考核机制”统一为核心,提升管控手段、整合信息数据、优化业务流程、强化考核监督,努力 建成管理集中高效、资源集约共享、业务集成贯通、综合保障有力的市县一体管控体系。

鸡贫血病毒凋亡素基因的可溶性融合表达及抗肿瘤活性分析

为获得高效可溶表达的鸡贫血病毒凋亡素基因(CAV-Apoptin),根据大肠杆菌密码子偏爱性优化CAV-Apoptin基因序列,将其连接到含msyB伴侣基因的pBCX载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定后应用镍柱亲和层析纯化蛋白质,采用显微镜观察、CCK-8实验与DNA ladders测定其抗肿瘤细胞的活性。结果显示,成功构建大肠杆菌表达载体pBCX-CAV-Apoptin,在37℃正常培养条件下的大肠杆菌中得到大量可溶性表达产物,融合蛋白质分子量大小约为42 kDa,50 ml菌液即可获得1.5 mg左右的纯化重组蛋白,CCK-8实验结果显示纯化后的重组蛋白作用36 h后可对套氏淋巴瘤JEKO-1、REC-1细胞生长产生超过60%的抑制率;显微镜观察与DNA ladder实验证明重组蛋白可诱导JEKO-1、REC-1细胞的凋亡,对HUVEC没有诱导凋亡的作用。免疫印迹分析表明重组凋亡素对JEKO-1细胞诱导了Caspase-3的激活,而对Caspase-8的表达没有影响。研究表明融合蛋白msyB-CAV-Apoptin可达到高效可溶表达,且表达产物具有特异抗肿瘤活性。

环介导等温扩增技术检测食品安全的研究进展

食品安全一直是全世界公众健康的关注焦点。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种特异性强、灵敏度高、快速简便的等温核酸扩增技术,近年来在核酸检测领域有着广泛的研究和应用。将LAMP技术应用到食品安全检测领域,可以快速准确的监控一些食品安全问题,避免对人类健康所构成的危害。因此针对LAMP技术在食品安全检测方面的优势进行分析,并结合LAMP技术与新兴诊断技术平台的联合运用进行了展望。

两广地区2011-2012年H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析

为探究两广地区H9N2亚型禽流感病毒（avianinfluenzavirus，AIV）的变异情况及分子流行规律，于2011-2012年从该地区发病鸡群中共分离到16株H9N2亚型A1V，并对分离株HA基因进行测序与进化分析。结果表明，分离株HA基因开放阅读框全长均为1683bp，编码560个氨基酸；HA基因核苷酸同源性为88．7％～99．6％，编码氨基酸同源性为91．8％～99．5％。本试验分离毒株与国内疫苗株（GD-SS、SH—F和SD-6）的核苷酸同源性在90．1％～92．6％之间，推导的氨基酸序列同源性在91．6％～94．8％之间。进化分析显示分离株可分为Group1和Group2两个亚分支，与疫苗株均属于欧亚谱系的Y280分支，但亲缘关系较远。分离株HA蛋白裂解位点附近序列有3种形式：PARSSR＋GLF、PSRSSR＋GLF和PARLSR0GLF，均无连续碱性氨基酸的插A，符合低致病性AIv的特征。本试验发现分离株GD4、GX2在HA1的127、295位分别增加一个潜在的糖基化位点；除分离株GD5和GD6外，其余分离株在HAl的216位发生Q216L氨基酸突变，表明其存在感染人的可能性。