高效液相色谱-串联质谱检测牛奶中的甲状腺素

建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测牛奶中甲状腺素3,3',5,5'-四碘-L-甲腺原氨酸(T4),3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)和3,3',5'-三碘-L-甲腺原氨酸(rT3)的方法。样品用乙腈提取,离心,上清液经氨水碱化和Cleanert PAX固相萃取小柱净化,在Zorbax Eclipse XDB-C18(150 mm×2.1 mm,3.5μm)色谱柱上以0.1%(v/v)乙酸水溶液和甲醇为流动相等度洗脱分离,以电喷雾正离子(ESI+)模式电离,多反应监测(MRM)模式质谱检测,内标法定量。结果表明,甲状腺素的检出限(LOD)不大于0.03 ng/g,定量限(LOQ)不大于0.1 ng/g;在考察的浓度范围内线性关系良好(r2>0.998);回收率为80.61%～101.7%,相对标准偏差(RSD)为1.48%～9.70%。室温下样品溶液中的甲状腺素保持稳定。对5个牛奶样品的测定结果显示,T3含量为0.59～1.30 ng/g,RSD为2.06%～7.70%;T4和rT3未检出。该方法具有样品处理简单,灵敏度高,重现性好,定性和定量结果可靠等特点,为牛奶中甲状腺素的测定和相关质量安全评价提供了可靠手段。

牛布鲁氏菌病间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立牛布鲁氏菌病血清学诊断方法,本研究以牛种布鲁氏菌B.abortus2308基因组为模板,PCR扩增其HSP70基因,构建重组表达质粒pET32a-HSP70,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达并纯化,SDS-PAGE结果显示,得到重组HSP70蛋白,HSP70主要以包涵体形式表达。经条件优化建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA(iELISA)方法,结果显示,iELISA最佳反应条件为:抗原HSP70包被浓度为0.2μg/孔,血清稀释度为1200,封闭液为5%脱脂奶粉,兔抗牛IgG-HRP稀释度为14000,显色10 min;该iELISA方法的临界值为0.186。特异性试验结果显示,除布鲁氏菌病阳性血清外,该iELISA与IBR、BVD和FMD阳性血清无明显交叉反应;敏感性试验结果显示,血清1400稀释时仍能有效检出布鲁氏菌;重复性试验结果显示。批内批间变异系数均小于10%,重复性好。利用本实验建立的iELISA方法与传统的虎红凝集和试管凝集试验同时对血清样品进行检测,比分析检测结果,结果显示该iELISA方法与其它两者符合率较高。利用本方法对秦皇岛未进行布鲁氏菌病免疫的规模化肉牛养殖场血清样品进行检测,布病抗体阳性率为2.5%。本研究建立的iELISA为牛布鲁氏菌病的血清学诊断提供了可行方法。

猪流行性腹泻病毒变异株XP2018的分离及S基因序列分析

本研究旨在从临床仔猪腹泻样品中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),并对其S基因进行测序分析。对腹泻仔猪小肠样品进行RT-PCR检测、病毒的分离培养、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定、S基因测序及遗传演化分析。结果显示:仔猪腹泻由流行性腹泻病毒引起;在Vero细胞上成功分离流行性腹泻病毒,命名为XP2018,该毒株细胞病变明显,并且连续传代细胞病变稳定;该毒株S基因全长为4161 bp,与中国经典毒株CV777 S基因核苷酸同源性为92.6%,氨基酸同源性为91.0%;与近年来中国分离的其他毒株S基因核苷酸同源性为96.9%~97.6%,氨基酸同源性为96.9%~98.0%;与美国参考毒株S基因核苷酸同源性为96.9%~97.6%,氨基酸同源性为96.6%~98.3%;遗传进化分析显示XP2018毒株与与目前中国流行毒株在同一分支,与经典毒株CV777不在一个分支上。本研究成功分离1株猪流行性腹泻病毒流行毒株,为PEDV疫苗研发奠定了基础。

美人鱼发光杆菌MCCC 1K03226株的全基因组测序及生物信息学分析

为了探究美人鱼发光杆菌MCCC 1K03226株的功能。本研究利用Megalign构建美人鱼发光杆菌16S r DNA遗传进化树,利用电镜观察菌株,并进行生化鉴定;采用PacBio RSII高通量测序平台对美人鱼发光杆菌进行全基因组测序;利用SMRT portal软件对测序所得基因进行组装拼接;利用NR、KEGG、COG等数据库和SignalP、EffectiveT3、antiSMASH等软件对MCCC 1K03226株进行基因功能注释;利用Circos软件绘制基因组环形图谱。通过遗传进化树、序列比对及生化鉴定结果显示,该菌为美人鱼发光杆菌美人鱼亚种;测序结果显示该菌基因组由2条染色体和1个质粒组成,共编码4 298个基因,GC含量为41.59%;基因功能分析显示,2 392个基因对应美人鱼发光杆菌,1 980个基因参与34类代谢通路;3 452个基因编码蛋白质;3 570个基因与分子功能相关;2 884个基因与细胞成分相关;6 526个基因与生物学过程相关;501个基因编码转运蛋白;5个基因与耐药性相关;97个基因编码的蛋白与致病性相关;317个基因编码分泌蛋白,其中192个蛋白为Ⅲ型分泌系统(T3SS)效应蛋白。本研究对美人鱼发光杆菌分离株MCCC 1K03226进行全基因组测序和生物信息学分析,为该菌的致病机制研究和疾病防控奠定基础。

2017-2018年河南省猪流行性腹泻病毒S基因序列分析

为分析河南省猪流行性腹泻病毒S基因的遗传变异情况,本试验于2017年10月—2018年2月从河南省8个规模化猪场采集80份有腹泻症状的仔猪肠道样品,利用RT-PCR方法进行猪流行性腹泻病毒检测,并对部分阳性样品进行S基因全长序列扩增、测序和遗传进化分析。结果显示,8个规模化猪场80份样品中共检测出6个场60份样品为猪流行性腹泻病毒阳性,阳性率为75%;选取的6株猪流行性腹泻代表株间S基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别是98.4%~99.9%和98.2%~100%,与经典毒株CV777之间的同源性分别是93.7%~94.9%和92.4%~94.6%;遗传进化分析显示,6株猪流行性腹泻代表株属于同一群,与CV777处在不同的分群,表明河南省猪流行性腹泻病毒流行毒株与疫苗毒株亲缘关系较远。本试验明确了河南省猪流行性腹泻病毒遗传变异情况,为猪流行性腹泻的诊断和防控提供了依据。

肠炎沙门菌glpK基因缺失株的生物学特性及其免疫效果评价的研究

为分析甘油激酶(GlpK)对肠炎沙门菌毒力的影响,本研究使用野生菌株c50336和glpK基因缺失菌株c50336ΔglpK进行体外模拟应激试验,分析glpK基因缺失对沙门菌抵抗应激环境的影响。将这两株菌分别以MOI 100感染鼠源巨噬细胞Raw264.7,在不同时间点计算胞内存活的细菌数,以评价glpK基因的缺失对沙门菌胞内存活率的影响;将菌株c50336和c50336ΔglpK腹腔注射小鼠,利用寇氏法计算各菌株对小鼠的半数致死量(LD;)。结果显示,与c50336相比,c50336ΔglpK在氧化和高渗环境中的存活率极显著降低(0.001<P<0.01),但在酸性和碱性环境中的存活率无明显变化,且在巨噬细胞内的存活率明显降低;LD_(50)测定结果显示,c50336ΔglpK和c50336对小鼠的LD_(50)分别为1.6×10^(7) cfu和6.7×10^(2) cfu。将菌株c50336ΔglpK以2.1×10^(6)cfu/只的剂量免疫BALB/c小鼠,14d后二免,首免28d时,以1.5×10^(5) cfu/只注射菌株c50336,计算15 d内小鼠的免疫保护率;按上述方法免疫小鼠一次,分别在免疫后3d、10d和21d,对各组小鼠采血分离血清,经间接ELISA检测小鼠血清抗体水平;取脾脏称重,计算脾脏指数;采用细菌计数法测定小鼠脾脏载菌量;制备免疫小鼠脾淋巴细胞悬液,分别经c50336ΔglpK全菌蛋白和ConA刺激,72 h后采用MTT法检测各组小鼠脾细胞的增殖能力。免疫保护率结果显示,glpK缺失株可对免疫小鼠提供100%的保护率,而攻菌对照组小鼠在攻菌后12 d全部死亡。脾脏指数和载菌量检测结果显示,与对照组相比,免疫后3d、10 d和21 d的免疫组小鼠脾脏指数均极显著升高(0.001<P<0.01),且10 d时脾脏指数最高;小鼠脾脏载菌量逐渐降低,并在免疫后21 d脾脏细菌被完全清除。血清抗体检测结果显示,免疫组小鼠抗体水平随免疫次数的增加而升高,而对照组小鼠血清抗体一直为阴性。淋巴细胞增殖能力检测结果显示,c50336ΔglpK全菌蛋白刺激的小鼠脾细胞增殖指数随免疫次数的增加而升高,与对照组差异均极显著(0.001<P<0.01).本研究结果首次证实glpK与肠炎沙门菌的毒力密切相关,且其缺失菌株可对小鼠提供良好的免疫保护。本研究为肠炎沙门菌glpK缺失株疫苗的研究奠定了基础。

多杀性巴氏杆菌脂多糖的结构和作用研究进展

从多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的疾病及其毒力因子、脂多糖的共同特性、多糖内核的分类、多糖外核的分类、在灭活的疫苗和减毒活疫苗中的作用等方面,综述了国内外对多杀性巴氏杆菌的研究进展,并对今后的研究方向进行了展望。

entB和entC基因缺失对肠炎沙门菌生物学特性影响的研究

为研究肠炎沙门菌肠杆菌素相关因子(entB)和异分支酸酶(entC)两个基因的作用,本研究利用λ-Red重组技术构建了肠炎沙门菌entC、entB单基因和双基因缺失菌株,在不同时间点检测菌液OD_(600nm)值并绘制生长曲线,利用ATB自动生化鉴定系统对其进行生化鉴定,并进行酸(pH3.5)、碱(pH10.0)、氧化应激(10 mmoL/L H2O2)体外模拟应激试验和小鼠的感染试验,分析基因entC和entB对肠炎沙门菌的影响。结果显示,通过同源重组技术,将氯霉素基因同源替换entC和entB基因,正确构建了单基因缺失菌株(c50336ΔentC和c50336ΔentB)及双基因缺失菌株(c50336ΔentC-entB);绘制的生长曲线结果显示,与c50336相比,单基因缺失株c50336ΔentC和c50336ΔentB生长延缓,双基因缺失株c50336ΔentC-entB生长延缓得更加明显;生化鉴定显示,基因entC和entB对肠炎沙门菌的部分生化特性有一定的影响;体外应激试验显示,双基因缺失菌株c50336ΔentC-entB显著降低肠炎沙门菌对酸、碱和氧化应激环境的抵御能力;动物感染试验结果显示双基因缺失菌株c50336ΔentC-entB对小鼠的毒力显著降低。本研究首次证实了entC和entB基因不同程度影响肠炎沙门菌的生长、抗应激能力和毒力,为深入研究entC和entB基因对肠炎沙门菌致病机制的影响奠定基础。

猪流行性腹泻病毒变异毒株与传统毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

为建立猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异毒株和传统毒株RT-PCR鉴别诊断方法,本研究根据GenBank中PEDV变异毒株(JN381492.1)和传统毒株(JN599150.1)S基因序列,设计两对特异性引物,进行反应条件优化。结果显示:建立的RT-PCR鉴别诊断方法能够特异性区分PEDV变异毒株和传统毒株,能扩增出变异毒株442 bp的目的片段,而传统毒株是270 bp的目的片段,并且与猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪呼肠孤病毒、猪瘟病毒、猪脑心肌炎病毒、轮状病毒均无交叉反应;敏感性结果表明该方法能检测出变异毒株和传统毒株的底限均为4×10^4 copies;利用该方法对42份临床腹泻样品进行检测,PEDV阳性率为69%(29/42),变异毒株占总PEDV毒株的93.1%(27/29),传统毒株占总PEDV毒株的6.9%(2/29)。该RT-PCR方法为PEDV的病原鉴别诊断和流行病学调查提供了技术手段。

布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建及免疫效果分析

利用Overlap PCR方法连接基因L7/L12和GroES,分别利用pET32a和pcDNA3.1构建原核和真核表达质粒,分别命名为pET32a-LG和pcDNA3.1-LG。原核表达并纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,用于验证真核表达载体目的基因的表达;重组真核表达质粒pcDNA3.1-LG转染293T细胞,经间接免疫荧光和Western blot验证蛋白成功表达。真核质粒免疫小鼠后,利用ELISA方法检测血清抗体水平,淋巴细胞转化试验检测细胞免疫水平,结果显示,该重组质粒具有良好的免疫效果。

GlpK影响肠炎沙门菌生物被膜形成

为研究肠炎沙门菌甘油激酶GlpK的功能,利用同源重组技术构建了肠炎沙门菌GlpK基因敲除株c50336ΔglpK,通过药物敏感性和生物被膜相关实验探究其在肠炎沙门菌生物被膜形成中的作用。研究结果显示,GlpK基因敲除后不影响细菌的体外生长,但可显著降低肠炎沙门菌形成生物被膜的能力和药物敏感性,且肠炎沙门菌Curli菌毛和纤维素的形成受到抑制,生物被膜相关基因的表达下调。研究结果表明GlpK基因参与肠炎沙门菌的耐药性和生物被膜形成,为肠炎沙门菌新型靶向药物的研发奠定了重要基础。