hPer1相互作用蛋白的筛选

目的应用酵母双杂交系统筛选血液中与人体生物钟蛋白Per1相互作用的新蛋白。方法以人Per1的basicHLH-PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选与之相互作用的新蛋白。阳性克隆送测序后用生物信息学分析。结果酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆。通过测序和生物信息学分析,其中之一能与Per1相互作用的蛋白为LSMD1。结论通过酵母双杂交系统证明Per1能够与LSMD1发生相互作用。

hPeriod1_(PAS)结构域相互作用蛋白的筛选和研究

目的寻找与近日节律系统核心基因Period1(Per1)相互作用的新蛋白,揭示近日节律相关的可能信号通路。方法采用酵母双杂交方法,以人Per1的PAS结构域为诱饵,扫描人下丘脑cDNA文库,并通过体外转录、免疫共沉淀验证蛋白间相互作用;通过RT-PCR检测RACK1(receptors for activated C-k inase)表达的组织特异性及节律性;运用RNA i技术初步研究RACK1与Per1的信号联系。结果人下丘脑区域RACK1蛋白与Per1存在相互作用;RACK1在多器官组织保守表达,但其表达未呈现明显节律性;上调及下调Per1表达,RACK1的RNA水平无显著变化。结论细胞内接头分子RACK1是一种新的Per1作用蛋白,可能介导、调控Per1的功能。

时间生物学研究进展

本文简要介绍时间生物学的研究进展,包括近日节律系统的基本特征、近日节律分子机制的研究进展和近日节律失调对人体的影响。根据时间生物学研究发展的现状,提出了其未来在载人航天研究领域和临床应用方面发展的前景和趋势,提出了建立“空间时间生物学”学科及学科研究的基本内容;在临床应用方面,提出了时间治疗学在治疗心血管疾病、内分泌系统疾病、肿瘤和睡眠调节等方面的应用前景。

层粘连蛋白受体Ⅰ与hPeriod1相互作用的研究

目的寻找与节律蛋白hPeriod1(hPer1)相互作用的蛋白,并对筛选出的层粘连蛋白受体Ⅰ(Lamr1)在节律系统中的功能作初步研究。方法分别构建pGAD rec脑/cDNA文库和pGBKT7/hPer1bH LH-PAS重组诱饵蛋白质粒,酵母双杂交筛选下丘脑里与hPer1相互作用的蛋白。利用RT-PCR技术检测新蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织中的表达及在SH-SY5Y细胞中的节律性质。通过RNA干扰技术研究新蛋白与hPer1的关系。结果通过酵母双杂交筛选,证明Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用。该蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织广泛表达,灰度比较显示经马血清诱导后的SH-SY5Y细胞的hPer1表达呈现近日节律,而Lamr1表达无节律变化。RNA干扰显示hPer1表达下调不影响Lamr1的表达。结论Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用,但其表达在RNA水平无节律变化。Lamr1参与细胞的黏附、转移和侵袭。其前体蛋白作为核蛋白参与细胞蛋白的合成。Lamr1可能参与hPer1相关的生物节律系统的信号传出。

节律蛋白mPERl在NIH3T3细胞增殖和迁移中的作用

目的研究PER 1蛋白对N IH 3T 3细胞增殖和迁移的影响。方法将重组表达质粒pcDNA 3.1/m PER 1转染入N IH 3T 3细胞中,并以未转染的N IH 3T 3细胞为对照,利用M TT法检测细胞增殖的改变。利用RT-PCR技术和W esternb lot检测节律蛋白m PER l对细胞迁移关键性蛋白基质金属蛋白酶2(MM P-2)表达的影响。结果M lTT法显示PER 1表达上调可以抑制N IH 3T 3细胞增殖,RT-PCR技术和W estern b lot检测显示在N IH 3T 3细胞中,当节律蛋白m PER 1表达上调时,细胞迁移关键性蛋白MM P-2在RNA和蛋白水平的表达较对照组降低。结论上调N IH 3T 3细胞内的PER 1蛋白表达能抑制细胞增殖以及细胞迁移的关键性MM P-2在RNA和蛋白水平的表达。

hClock-(35-47)的表达、纯化及其功能的检验

目的构建hClock-(35-47)的表达质粒,进行诱导表达,纯化,在体外初步鉴定其跨膜功能。方法合成hClock-(35-47)全长DNA序列,重组入pET-32a表达载体中,测序鉴定后转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,构建好重组体的表达菌株。IPTG诱导并优化表达后,以NTA-Ni亲合层析进行分离纯化,及SDS-PAGE和Western bloting鉴定。纯化鉴定后的hClock-(35-47)用FITC标记,以一定的浓度孵育体外培养的血管内皮细胞(ECV-304),荧光显微镜下观察其穿膜活性。结果成功构建了hClock-(35-47)的表达载体,插入片断为51bp,表达产物相对分子质量约为21kD,经Western bloting鉴定,与抗His-Tag抗体有特异性反应,与培养的ECV-304孵化,显示具有穿膜功能。结论原核表达的hClock-(35-47)仍然保留其穿膜功能,为进一步研究提供基础。