ERK抑制剂U0126通过下调cyclin D1与survivin蛋白表达抑制乳腺癌细胞增殖

目的 研究ERK通路抑制剂U0126对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,并探讨其调控机制。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB231,将细胞分组干预,MTT法检测各组细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡;Western blot检测细胞中p-ERK/ERK、cyclin D1、survivin及cleaved caspase-3蛋白表达。结果 MTT结果显示,U0126干预24、48 h后,MCF-7、MDA-MB231细胞抑制率明显增加(P<0.01);MCF-7、MDA-MB231细胞经U0126干预24 h后,检测细胞周期及细胞凋亡,G 0/G 1期细胞比例较对照组明显增加,S及G 2期细胞比例下降(P<0.05);而干预组细胞凋亡率较未干预组明显增多(P<0.01);U0126处理人乳腺癌细胞2 h后,可阻断ERK的磷酸化,减少cyclin D1的蛋白表达,抑制survivin而上调cleaved caspase-3的表达,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。结论 U0126通过阻断MCF-7、MDA-MB231细胞中ERK信号通路,调控cyclin D1,将细胞周期阻断在G 0/G 1期,抑制survivin而增加cleaved caspase-3表达,增加细胞凋亡,继而使乳腺癌细胞MDA-MB231、MCF-7的增殖受到抑制。

白藜芦醇通过抑制系膜区细胞增殖下调PDGF-B、TGF-β1表达减缓大鼠IgAN进展

目的探讨SirT1激动剂白藜芦醇(resveratrol,Res)对IgAN大鼠的治疗效果及其作用机制。方法建立IgA肾病大鼠模型,将大鼠随机分成4组:正常对照组(Control组)、IgA肾病组(IgAN组)、正常对照+Res组(Control+Res组)、IgA肾病+Res组(IgAN+Res组)。丽春红S法检测尿蛋白及自动生化分析仪检测各项生化指标;PAS和Masson染色法观察肾脏病理改变;免疫荧光观测IgA沉积情况;免疫组化法检测PDGF-B、TGF-β1的表达。结果与IgAN组相比,白藜芦醇干预组24 h尿蛋白量、尿素氮、血肌酐表达明显降低,肾小球IgA荧光沉积明显减少;IgAN组后期系膜区细胞及基质增生、肾小球体积增大均受到明显抑制;白藜芦醇还显著降低IgAN组PDGF-B、TGF-β1的高表达。结论白藜芦醇能够显著减少IgA肾病大鼠肾脏IgA免疫复合物在系膜区的沉积,并通过抑制系膜区细胞增殖下调PDGF-B及TGF-β1的表达来减轻肾小球硬化,从而起到减缓大鼠IgA肾病进展的作用。

胺碘酮对人脐静脉内皮细胞的损伤作用及机制研究

目的探讨胺碘酮对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的损伤作用及可能的机制。方法取经过3代培养的HUVEC接种于96孔板,加入0、10、20、30或60μmol/L胺碘酮培养24 h,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力,以0μmol/L组细胞活力为100%,计算各加药组的相对细胞活力。选择可将细胞活力降至70%左右的胺碘酮浓度用于后续各项实验。采用CCK-8法检测该浓度胺碘酮作用不同时间(6、12、24、36、48 h)对HUVEC活力的影响。以加入该浓度胺碘酮培养的HUVEC为实验组,不加入者为对照组,采用钙依赖性磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应法分别检测B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、白细胞介素10(IL-10)、IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白和mRNA表达水平;2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针法检测活性氧(ROS)含量,水溶性四氮唑-1法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,微板法检测还原型谷胱甘肽(GSH)含量。结果经10、20、30、60μmol/L胺碘酮作用24 h的各加药组HUVEC活力与对照组(100%)相比分别为(88.82±2.64)%、(74.96±1.75)%、(64.95±2.10)%和(18.57±0.65)%,各加药组与对照组比较以及加药组之间两两比较均P<0.01。选择30μmol/L胺碘酮用于后续实验。经30μmol/L胺碘酮作用6、12、24、36、48 h的各实验组HUVEC活力与对照组(100%)相比分别为(90.19±1.88)%、(82.81±2.51)%、(75.33±1.37)%、(65.76±1.85)%和(47.01±3.29)%,各实验组与对照组比较以及实验组之间两两比较均P<0.01。实验组细胞凋亡率明显高于对照组(48.59%比16.34%,P<0.01),促凋亡蛋白Bax和caspase-3以及促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白和mRNA表达水平均高于对照组(均P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2和抗炎因子IL-10的蛋白和mRNA表达水平均低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论胺碘酮可导致HUVEC损伤,这种损伤作用随胺碘酮浓度升高和作用时间延长而增强;胺碘酮可能通过诱导细胞凋亡、炎症反应及氧化应激导致HUVEC损伤。

雷帕霉素通过mTORC1/p70S6K通路调控大鼠系膜细胞增殖及细胞周期的机制研究

为了探究雷帕霉素对大鼠系膜细胞增殖、细胞周期的影响及其作用机制,将大鼠系膜细胞(HBZY-1)分为以下6组:对照组(control)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)20 ng·mL^-1组、PDGF+雷帕霉素1、10、100和1000 nmol·L^-1组;MTT法和流式细胞术检测雷帕霉素(1、10、100、1000 nmol·L^-1)作用后对细胞增殖和周期的影响;Western blot法检测周期蛋白D1(cyclin D1)、周期蛋白E(cyclin E)、周期素依赖性蛋白激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、周期素依赖性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)、p70S6K/p-p70S6K和p27的蛋白表达;Real-time-PCR法检测p27 mRNA。结果显示,雷帕霉素能显著抑制PDGF刺激系膜细胞(glomerular mesangial cells,MCs)引起的增殖,且呈剂量及时间依赖性,但随着浓度增加(1~1000 nmol·L^-1),时间依赖性逐渐减弱;雷帕霉素可以将细胞周期阻滞在G0/G1期;对照组cyclin D1、cyclin E及CDK2、CDK4表达较低,PDGF组各蛋白表达均上调,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),但雷帕霉素干预组与PDGF组比较,cyclin D1、cyclin E及CDK2、CDK4的表达均未见明显改变;雷帕霉素可以明显抑制p70S6K磷酸化,上调p27蛋白及mRNA的表达。上述结果表明,雷帕霉素具有抑制系膜细胞增殖的作用,该作用是通过mTORC1/p70S6K通路调控p27mRNA转录,使其蛋白表达增加,导致cyclin-CDK的活性降低,将细胞周期阻断在G0/G1期实现的。