重组人抑癌相关蛋白核苷二磷酸激酶A的原核表达

目的 :为提高表达量 ,简化纯化工艺 ,获得可用于临床研究的重组人NDPK -A蛋白 ,构建带有 6×His纯化标签的原核表达载体 ,优化表达条件获得产物高表达并鉴定产物活性。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒pBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中 ;梯度变化表达条件获得产物高表达 ;镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白 ;Westernblot鉴定产物的免疫原性 ;HPLC测定产物的激酶活性 ;鸡胚尿囊膜试验鉴定产物抑制血管新生的生物活性。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列无误 ;目的蛋白最高表达量可达 4 9 6 % ;纯化的表达产物能与天然NDPK -A的多克隆抗体特异结合 ;酶比活为 4 72U/mg ;具有抑制鸡胚尿囊膜血管新生的活性。结论 :表达质粒pQE -nm2 3H1能高效表达重组人NDPK -A ,纯化工艺简便 ,产物活性与天然NDPK -A无异。

新型rhNDPK-A工程菌的构建及表达产物纯化研究

目的 :为简化纯化过程 ,获得有临床研究价值的rhNDPK -A蛋白 ,构建新型rhNDPK -A基因的表达质粒 ,利用 6×His标签以Ni+ -NTA亲和层析柱纯化蛋白。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒PBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中。IPTG诱导表达目的蛋白。通过镍离子螯合层析柱一步纯化法纯化目的蛋白。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列完全正确 ;目的蛋白在大肠杆菌M15中的表达量可达 4 9.6 % ;Ni+ -NTA亲和层析柱一步纯化后蛋白纯度为 93%。结论 :构建了带有 6×His纯化标签的新型rhNDPK -A基因表达质粒pQE -nm2 3H1,所构建质粒能高效表达目的蛋白 ,利用Ni+ -NTA亲和层析柱简便高效地纯化了表达产物。

核酶在AIDS基因治疗中的研究新进展

利用核酶的核酸内切酶活性将核酶应用于 AIDS基因治疗的研究 ,近几年来有了许多新的突破 ,本文主要在核酶作用的位点。

BALB/C小鼠对不同佐剂SARS灭活疫苗的早期免疫反应

目的 :研究含不同佐剂的SARS灭活疫苗免疫小鼠后 ,小鼠的早期细胞免疫和体液免疫反应。方法 :灭活的SARS冠状病毒F6 9株分别与弗氏佐剂、氢氧化铝、CpG佐剂配伍 ,制备灭活疫苗。接种 6周龄SPF级BALB C小鼠。定时采血 ,分析小鼠外周血中CD4 + 、CD8+ T细胞亚群动态变化 ,同时测定鼠血清中特异性IgG抗体及抗体的病毒中和活性。结果 :由3种佐剂制备的SARS灭活疫苗免疫小鼠后 ,CD4 + 、CD8+ T细胞百分比升高或无明显改变 ,CD4 CD8比值无显著性改变。其中 ,弗氏佐剂疫苗免疫小鼠的CD4 + T细胞百分比升高较明显 ,且在一段时间内 ,维持在一个较高的水平 ;铝佐剂疫苗免疫小鼠后 ,未观察到明显T细胞亚群改变 ;而CpG佐剂疫苗免疫小鼠的CD8+ T细胞百分比改变较其它佐剂疫苗改变更明显。与此相异的是 ,3种疫苗均可诱导小鼠产生较高滴度特异性IgG抗体 ,并且所产生的抗体具有中和活性。在初免后第 34天 ,3种佐剂组的IgG抗体滴度分别为 1∶1 2 80 0、1∶32 0 0和 1∶1 6 0 0 ,中和效价分别为 1∶2 5 6 0、1∶96 0和 1∶32 0。结论 :SARS灭活疫苗接种小鼠后 ,可诱导较强的体液免疫反应 ,同时轻度上调CD4 + 、CD8+ T细胞活性 ,程度因佐剂而异。

还原酶缺陷型大肠杆菌对重组蛋白溶解性的影响

探讨大肠杆菌细胞质氧化还原环境对重组蛋白溶解性的影响。选择含有 1对二硫键的牛碱性成纤维细胞生长因子 (BbFGF)作为简单蛋白的模式分子 ,选择含有 2对二硫键的人抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)作为复杂蛋白的模式分子 ,分别构建表达质粒并转化普通宿主菌和还原酶缺陷型宿主菌E .coliOrigami(DE3) ,比较表达产物的溶解性和纯化产物的活性。结果发现 ,BbFGF在普通宿主菌中大部分形成包涵体 ,在Origami(DE3)中为可溶性表达 ,但表达量降低。两种工程菌的表达产物经离子交换和肝素亲和层析两步纯化后 ,MTT法测定活性 ,发现来自还原酶缺陷型宿主菌的BbFGF活性高于普通宿主菌表达产物 ,二者的ED50 分别是 1 6ng mL和 2 2ng mL ;HBscFv在两种宿主菌中均形成包涵体 ,包涵体以 6mol L盐酸胍缓冲液溶解后 ,镍离子螯合亲和层析纯化并透析复性 ,间接ELISA测定抗原结合活性 ,发现二者活性无明显差异 ,但在Origami(DE3)菌体破碎后的的上清中可检测到HBscFv活性 ,纯化后产量为 1～ 2mg L ,而在普通宿主菌破碎后的上清中检测不到HBscFv活性。上述结果说明 ,改变宿主菌细胞质氧化还原环境对于含有 1～ 2对二硫键的重组蛋白的可溶性表达具有明显促进作用。

pQE-hbFGF表达系统的构建及其蛋白质的表达和纯化

目的 构建pQE hishbFGF表达载体 ,通过一步纯化得到 6×HishbFGF蛋白质。方法 用PCR扩增目的基因hbFGF ,连接到pQE4 0载体上 ,转化到Top10菌株筛选重组子 ,经测序后将质粒转化到表达菌M15上 ,经IPTG诱导表达 ,超声波破菌后通过镍离子螯合层析一步纯化得 6×HishbFGF蛋白质 ,ELISA鉴定产物 ,用MTT法检测产物促细胞增殖的生物活性。结果 hbFGF基因插入pQE载体中 ,在M15中 6×HishbFGF的表达量达到 2 0 % ,且为可溶性表达。经一步纯化后得到N端带 6个组氨酸的hbFGF蛋白 ,纯度为 96 % ,6×HishbFGF具有免疫原性及促进NIH3T3细胞增殖的活性。结论 6×HishbFGF蛋白质在M15中可溶性地高效表达 ,并经一步亲和层析得到纯度高活性高的产物 ,降低了生产成本 。

Inhibiting severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus by small interfering RNA

OBJECTIVE: To evaluate the effectiveness of small interfering RNA (siRNA) on inhibiting severe acute respiratory syndrome (SARS)-associated coronavirus replication, and to lay bases for the future clinical application of siRNA for the treatment of viral infectious diseases. METHODS: Vero-E6 cells was transfected with siRNA before SARS virus infection, and the effectiveness of siRNA interference was evaluated by observing the cytopathic effect (CPE) on Vero-E6 cells. RESULTS: Five pairs of siRNA showed ability to reduce CPE dose dependently, and two of them had the best effect. CONCLUSION: siRNA may be effective in inhibiting SARS-associated coronavirus replication.