软骨脱细胞基质/丝素蛋白活性支架的构建及其软骨组织工程研究

目的·利用软骨脱细胞基质(acellular cartilage matrix,ACM)与复合天然丝素蛋白(silk fibroin,SF)生物材料,构建具有双网络交联的生物活性组织工程支架,用于软骨组织再生。方法·用核酸酶消化法消化掉软骨组织中细胞相关的免疫原性成分,并将细胞外基质相关糖蛋白、胶原结构保留,用DNA、组织糖胺多糖、胶原定量试剂盒通过分光光度仪检测软骨组织脱细胞效率。将ACM和SF配置成混合溶液,通过加入乙二醇二缩水甘油醚与两者所含羟基、氨基发生亲核交联反应,冷冻干燥制成多孔仿生支架(n=5),同时以相同方法制备仅含有ACM或SF的多孔支架(n=5)。扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察支架微观孔隙结构,并通过力学测试对不同组支架的力学强度、弹性模量以及回弹性进行评估,以吸水率反映支架的内外物质交换能力。分离并培养兔耳软骨细胞,接种于ACM-SF支架上,SEM观察培养1、4、7 d后细胞在支架上的黏附、分布与基质分泌情况,活/死细胞双染色观察细胞活力状况,通过CCK-8检测支架的细胞毒性,并于裸鼠皮下植入细胞支架复合物,体内培养4周、8周后,行组织学检测。各组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果·经酶消化后的软骨脱细胞基质几乎无细胞残留,并保留了软骨细胞外基质活性成分。ACM-SF制备的复合支架具有相互连通的微孔结构和良好的弹性,湿态下多次压缩后能恢复原状,ACM-SF的吸水率达到了近20倍,为细胞黏附环境提供了有效的物质交换条件。此外,该支架无生物毒性,具有促进软骨细胞增殖的能力;组织学检测显示,ACM-SF支架可在体内再生均质、典型的软骨组织。结论·ACM-SF复合多孔支架具有良好的仿生微环境,可应用于组织工程软骨再生。