小鼠髓样细胞触发受体-2基因小发卡状RNA慢病毒载体构建

目的构建小鼠髓样细胞触发受体-2(TREM2)基因小发卡状RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,并检测其功能。方法针对小鼠TREM2基因设计合成3对sh RNA序列,将其分别与线性化GV248载体连接,转化至感受态大肠埃希菌DH5α,构建TREM2基因sh RNA重组慢病毒载体(TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3)。用重组载体转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光(GFP)后,进行滴度测定。取对数生长期BV2小胶质细胞,分为TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组及空白对照组。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组分别感染TREM2-sh RNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3、sh RNA空质粒,空白组不做任何处理。感染120 h取各组细胞,Q-PCR法检测各组TREM2 m RNA,计算细胞沉默效率。结果 TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3转染293T后镜下均观察到GFP,包装浓缩的慢病毒滴度分别为(4×108)、(4×108)、(5×108) TU/m L。与空白对照组和阴性对照组比较,TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组TRME2 m RNA相对表达量均降低(P均<0. 05);与TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-3感染组比较,TREM2-shRNA-2感染组TRME2 m RNA相对表达量降低(P均<0. 05)。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组的沉默效率分别为49. 4%±3. 98%、79. 7%±2. 01、65. 3%±2. 41%和39. 2%±6. 98%,TREM2-shRNA2组沉默效率最高。结论成功构建TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3。TREM2-sh RNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3均可沉默小鼠BV2小胶质细胞中TREM2基因表达,以TREM2-shRNA-2沉默效果最好。

TREM2基因过表达慢病毒载体的构建及其表达的研究

目的:构建小鼠编码2型髓样细胞触发受体(TREM2)基因过表达慢病毒载体,并且对其体外表达目的基因的水平进行检测。方法:采用PCR扩增TREM2基因片段,将扩增产物连接至经AgeI酶切后的线性化GV358载体;经PCR方法鉴定及DNA测序比对分析后,将其和包装质粒共转染至293T细胞并用药筛法行滴度测定。然后用重组慢病毒感染293T细胞,观察GFP表达并用实时定量PCR检测TREM2的表达水平。结果:通过PCR成功获得TREM2基因片段并连接到GV358病毒载体上,通过PCR及DNA测序鉴定均证实TREM2-GV358携带有正确的TREM2基因;在293T细胞中包装获得病毒并用药筛法测定病毒滴度为2.0×10~8 TU/mL。感染293T细胞后可观察到大量明显的荧光细胞;实时定量PCR检测结果显示,TREM2过表达慢病毒感染293T细胞后TREM2的表达水平明显增加(P<0.05)。结论:成功构建TREM2-GV358慢病毒载体,为TREM2基因的后期研究提供了实验基础。