狂犬病病毒核衣壳蛋白的原核表达与鉴定

为实现狂犬病病毒核衣壳蛋白在原核系统中高效表达,参考GenBank中发布的RV N基因序列(登录号为1489853),在不改变RV N蛋白氨基酸序列的情况下,对该基因的密码子进行优化,化学合成N基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a(+)/RV N,将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用His-tag镍柱进行重组RV N蛋白的纯化,对纯化后的RV N蛋白进行SDS-PAGE鉴定及Western blot分析。结果表明:重组质粒双酶切后在1359 bp处有目的条带,经测序后与其所对应的已知基因序列完全相符,当重组菌在IPTG浓度0.1mmol/L、30℃诱导6 h,RV N蛋白表达量最高;经过镍柱纯化获得了RV N重组蛋白;BCA法测得重组RV N蛋白浓度达1.783 mg/mL;在51KD处可见明显的蛋白印迹,与预期目的条带相符;使用该方法成功在大肠杆菌系统高效表达了RV N蛋白,为后续狂犬病的检测与新型疫苗的研制奠定了基础。

犬瘟热病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体,从而为建立CDV的诊断方法提供有效试剂。将纯化后的CDV核蛋白作为免疫原注射至BALB/c小鼠腹腔中,取经4次长程免疫和1次加强免疫并达到融合标准的小鼠脾脏刮制成悬液,与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合制备杂交瘤细胞,利用间接ELISA筛选,并对单抗进行生物特性鉴定。结果表明:经过筛选后共获得2株可持续分泌抗CDV NP的单克隆细胞株,以3-3G、1-10B命名。2株细胞株抗体经效价测定均可达到1∶2 048 000;经亚型鉴定,2株杂交瘤细胞均为IgG2型;经过protein A柱纯化,抗体纯度达到了90%以上;BCA法测得抗体浓度至少达2.78 mg/mL;通过Western blot鉴定,制备所得CDV NP单克隆抗体与纯化的CDV NP抗原在预期的60 kd处有蛋白免疫印迹条带。该研究制备的单克隆抗体为后续犬瘟热的检测方法的研究奠定了基础。

甲胎蛋白AFP的原核表达、纯化及鉴定

为实现甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)在原核系统中高效表达,在GenBank上查找AFP全基因序列(GenBank登录号:NM_001134.2),分析AFP基因序列及大肠杆菌密码子偏好性优化,化学合成AFP全基因。以pET28a(+)作为原核表达载体并转化至BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。利用镍柱纯化AFP重组蛋白,并对纯化的AFP重组蛋白进行SDS-PAGE纯度分析、BCA蛋白浓度测定、Western-blot特异性鉴定。结果表明:AFP重组质粒经过Nde I、Xhol I双酶切鉴定,在1875 bp处出现特异性条带,与预期相符合;当诱导条件为30℃,0.1 mM的IPTG,诱导8 h,AFP重组蛋白可大量表达;BCA法测得AFP重组蛋白浓度达0.9239 mg/mL;纯化后的AFP重组蛋白与市售的AFP单抗进行Western blot鉴定,结果显示在75 kD处有明显的蛋白印迹,pET28a(+)/BL21(DE3)空白组无条带,表明AFP重组蛋白可在大肠杆菌中高效表达,且经Ni柱纯化后具有良好的特异性。研究实现了AFP重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,为后续AFP的检测、以AFP为分子靶点的抗癌药物筛选奠定了基础。

甲胎蛋白单克隆抗体制备及微粒操控检测方法建立

目的制备甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)单克隆抗体并鉴定其生物学特性,以该抗体初步建立基于微粒操控技术的AFP抗原快速检测方法。方法以重组表达的AFP蛋白为免疫原,腹腔免疫8周龄雌性Balb/c小鼠。取4次免疫后小鼠的脾细胞,以PEG1500为诱导剂与骨髓瘤细胞进行融合,筛选分泌AFP抗体的单克隆杂交瘤细胞株,将该细胞株注射Balb/c小鼠并制备AFP单抗。将制备的AFP单抗固定于微电极芯片表面,通过交流动电效应加速AFP抗原富集到微电极芯片并与AFP单抗发生特异性的免疫结合反应,芯片连接阻抗仪即可监测免疫反应情况,初步建立基于交流动电效应与阻抗免疫传感相结合的AFP抗原检测方法,并对该方法进行评价。结果共筛得7株能稳定分泌抗AFP单抗的杂交瘤细胞株,诱导的小鼠腹水型抗体效价达到1∶2048000以上。建立了基于微粒操控技术的AFP抗原快速检测方法。检测芯片的最佳清洗方式是:异丙醇超声清洗10 min→无水乙醇超声清洗10 min→超纯水超声清洗10 min;AFP抗体的最佳包被条件是10μg/ml、37℃、1 h。微粒操控技术检测AFP抗原加标血清的下限达1 ng/ml,肝癌血清样品的检出阳性率达95%,特异性(检出阴性率)达96.7%。结论制备了特异性、高效价的AFP单克隆抗体,以此AFP抗体建立的微粒操控技术具有良好的特异性、重复性及较高的灵敏度,无复杂的数据处理及反复清洗步骤,以较低的成本实现血清肝癌标志物AFP在1 min内快速完成现场检测,具有较高的临床应用价值,为肝癌的早期诊断提供了一种新的检测技术。

犬瘟热病毒核衣壳蛋白的原核表达与鉴定研究

为了实现犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)核衣壳蛋白(N蛋白)在原核表达系统中的高效表达,试验参考GenBank中发布的CDV N基因序列(登录号为DQ522030.1),在不改变N蛋白氨基酸序列的情况下,对该基因的密码子进行优化,化学合成N基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-CDV N,将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,经IPTG诱导表达后利用His-tag镍柱进行纯化,对纯化后的CDV N重组蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定、浓度测定、Western-blot鉴定,并用犬瘟热抗原快速检测卡检测该重组蛋白的免疫反应性。结果表明:经PCR扩增成功合成大小约为1581 bp的CDV N基因;重组质粒pET28a-CDV N经过NdeⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,在1581 bp处出现条带,与预期结果相符;在诱导温度为30℃、IPTG诱导终浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为8 h时,CDV N重组蛋白的表达量最高。经His-tag镍柱纯化,得到的CDV N重组蛋白纯度较高,浓度达1.7830 mg/mL,在60 ku处可见明显的蛋白印迹,犬瘟热抗原快速检测卡可检测出清晰的条带。说明CDV N重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,且免疫反应性良好。