奉贤东部地区缺血性脑卒中患者抗血小板药物抵抗现状及其影响因素分析

目的分析奉贤东部地区缺血性脑卒中患者抗血小板药物抵抗发生情况及其影响因素,为临床个体化治疗提供参考依据。方法回顾性分析奉城医院神经内科住院服用阿司匹林、氯吡格雷或二者合用的缺血性脑卒中患者282例,检测入院服药后血小板最大聚集率(MAR)。统计患者的临床资料;分析患者抗血小板药物抵抗发生情况;分析血小板药物抵抗的影响因素。结果282例患者单用阿司匹林的61例,单用氯吡格雷的23例,阿司匹林+氯吡格雷的198例;阿司匹林抵抗(AR)发生率为37.5%(97/259),氯吡格雷抵抗(CR)发生率为46.6%(103/221)。AR患者合并糖尿病比例35.1%高于阿司匹林非抵抗(NAR)患者的22.8%(P<0.05);AR患者与NAR患者年龄、性别、合并高血压、合并冠心病、吸烟史、血小板计数、血小板平均体积、血小板体积分布宽度、大血小板比率(P-LCR)、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、糖化血红蛋白、同型半胱氨酸、纤维蛋白原比较无统计学差异(P>0.05)。CR患者女性比例49.5%高于氯吡格雷非抵抗(NCR)患者的35.6%(P<0.05);CR患者与NCR患者年龄、合并高血压、合并糖尿病、合并冠心病、吸烟史、血小板计数、血小板平均体积、血小板体积分布宽度、大血小板比率、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、糖化血红蛋白、同型半胱氨酸、纤维蛋白原比较无统计学差异(P>0.05)。Logistic回归分析结果显示,合并糖尿病是AR的独立危险因素(P<0.05)。结论奉贤东部地区缺血性脑卒中患者以高于65岁的老年患者为主,抗血小板药物实验室抵抗率较高且CR率高于AR率,女性较男性更易发生CR;合并糖尿病是AR的独立危险因素,临床工作中应对老年缺血性脑卒中患者积极控制血压血糖,关注是否存在AR、CR,且给予个体化治疗。

基于AFLP分析用吴茱萸叶高质量DNA的提取

目的：研究吴茱萸叶基因组DNA的提取方法,以用于扩增片段长度多态性（AFLP）分析。方法：设计了一种改良CTAB法：以石英砂代替液氮研磨;抽提前用不溶性PVP结合酚形成络合物,然后用缓冲液除去;抽提中加入Vc。将改良CTAB法所提吴茱萸叶DNA与传统的SDS法、CTAB法所提DNA进行比较。利用植物的核糖体DNA（rDNA）保守序列设计引物行PCR扩增鉴定吴茱萸DNA及其质量。并确定提取方法中最佳样本含量和β-巯基乙醇浓度。结果：改良CTAB法提取石虎、疏毛吴茱萸总DNA呈白色,A260/A280为1.721~1.886,DNA分子完整,约20kb左右,PCR扩增条带清晰、明亮,无杂带和脱尾。并确定0.10g为最佳样本量,2.0%为最佳β-ME浓度。结论：石英砂研磨简便、迅速、均匀,该实验所建立的改良CTAB法可有效避免次生代谢物的氧化褐变,是一种小量、快速提取吴茱萸叶DNA优化方法。

吴茱萸的AFLP指纹图谱的初步研究(英文)

首次报道中草药植物吴茱萸基因组DNA指纹图谱的研究。吴茱萸是贵州省内经济价值极高的中草药之一,采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术来分析来自不同地区的石虎、疏毛、大花吴茱萸3个品种的DNA指纹图谱,从18对引物中筛选出3对引物对19份材料的DNA检测,共得到93条带,其中多态性片段57条(平均61.3%)。3对引物组合从DNA指纹图谱上将19份材料完全区分开,结果表明AFLP技术是鉴别吴茱萸相近品种的有效方法,是形态学鉴定方法的有益补充;UPGMA方法聚类分析显示19份种质材料间的相似系数为0.235～0.941,表明吴茱萸种质间的遗传多样性丰富;余庆地区种植基地的石虎和疏毛样本聚为一类,提示人工栽培影响到吴茱萸的遗传特性。

乳腺癌FHIT基因微卫星不稳定性及其蛋白表达的研究

目的分析乳腺癌脆性三联组氨酸基因(FHIT)微卫星不稳定性发生情况及与FHIT蛋白表达缺失的关系,以探讨乳腺癌发生的机制。方法选取FHIT基因的D3S1234、D3S1300位点,采用PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染法,对66例乳腺癌患者肿瘤组织进行微卫星不稳定性(MSI)检测,用免疫组化方法检测FHIT蛋白的表达情况。结果30.3%(20/66)的乳腺癌组织至少在一个位点出现MSI;59.1%(39/66)的肿瘤组织发生FHIT蛋白表达缺失或明显下降,17例MSI(+)病例发生FHIT蛋白低水平表达或缺失,MSI(+)与FHIT蛋白表达缺失有相关性(P<0.05)。FHIT蛋白表达缺失与肿瘤组织学分级有相关性(P<0.05)。结论FHIT基因位点的微卫星不稳定性是FHIT蛋白表达下调的可能的分子机制之一,FHIT基因在乳腺癌的发生发展中起重要作用。

血清GSTP1基因甲基化定量分析在肝细胞癌的早期诊断价值

目的建立实时荧光定量甲基化方法研究肝细胞癌(HCC)患者外周血血清中游离谷胱甘肽-硫-转移酶P1基因(GSTP1)启动子区域甲基化状态,探讨其是否可作为HCC早期诊断的指标。方法收集95例血清标本,包括40例HCC、30例肝硬化和25例健康体检者,采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)技术对血清中GSTP1基因的甲基化水平进行定量分析,应用接受者操作特性(ROC)曲线评估其诊断价值。结果肝癌患者血清中GSTP1基因甲基化定量水平明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析表明通过GSTP1基因甲基化定量分析能够高效区分肝癌和肝硬化及健康者(AUC=0.864 1),以甲基化率2%作为诊断HCC的临界值,其诊断特异度为87.5%,敏感度达69.6%;联合检测血清GSTP1基因甲基化和血清AFP可将HCC检出率提高至75%。结论实时荧光定量甲基化方法可精确定量血清中GSTP1基因甲基化水平,在HCC的早期诊断中有一定的应用价值。

乳腺癌3p14区域杂合性缺失与乳腺癌发生发展的关系

目的:探讨乳腺癌染色体3p14区域等位基因杂合性缺失与乳腺癌发生、发展的关系及与其临床病理特征之间的关系。方法:采用聚合酶链反应银染技术结合二核苷酸(CA)n重复序列出现多态性评价杂合性缺失(Loss of heterozygosity,LOH)。分析66例乳腺癌及45例乳腺乳头状瘤病的D3S1234、D3S1300位点的LOH,用免疫组化方法观察雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和c-erbB-2在乳腺癌中的表达情况。结果:乳腺癌组D3S1234、D3S1300位点的LOH发生率分别为38.0%(22/58)、34.5%(19/55),55.0%(33/60)的乳腺癌组织至少在一个位点存在LOH;乳头状瘤病组分别为32.5%(13/40)、28.2%(11/39),42.5%(17/40)的乳头状瘤组织至少在一个位点存在LOH,乳腺癌及乳腺乳头状瘤病在两位点的LOH无统计学差异(P>0.05)。轻度和中、重度乳头状瘤病的两位点LOH率有统计学差异(P<0.05),中、重度乳头状瘤病患者LOH率高于轻度患者。乳腺癌染色体3p14区域杂合性缺失与病人年龄、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移、c-erbB-2无明显相关性(P>0.05),与ER(-)、PR(-)有明显相关性(P<0.05)。结论:染色体3p14区域D3S1234、D3S1300杂合性缺失是乳腺癌发生的早期和频发事件,与乳腺癌的癌变进展可能相关,与乳腺癌的预后判断可能无相关性。并提示双座位的LOH可能有助于判断高风险的癌前病变。

肝细胞癌患者血浆循环DNA的定量分析及临床意义

目的定量检测肝细胞癌(HCC)患者血浆循环DNA(cf-DNA)含量,探讨其在原发性肝癌早期诊断及病情监测中的临床应用价值。方法收集40例肝细胞癌、30例代偿期肝硬化、20例活动性肝炎和25例正常健康对照血浆,提取血浆循环DNA,采用real-time实时荧光定量PCR方法检测β-actin基因的表达,确定血浆循环DNA的水平。结果 HCC组、肝硬化组、肝炎组和健康对照组中位血浆循环DNA浓度分别为17.090ng/ml、8.182ng/ml、7.447ng/ml和9.014ng/ml,HCC组和健康对照组循环DNA水平比较有显著性差异(P<0.05);肝硬化组、肝炎组和健康对照组比较无显著性差异(P>0.05),ROC曲线分析表明血浆循环DNA水平能够区分肝癌和健康人(AUC=0.8450),以循环DNA水平11.92ng/ml作为诊断HCC的临界值,其诊断的特异度是84.0%,敏感度是72.5%。血浆cf-DNA浓度与AFP联合检测可以将HCC诊断率提高至77.5%。结论 real time PCR技术可精确定量血浆循环DNA浓度,检测血浆中循环DNA含量可作为诊断和监测原发性肝癌指标的有效补充。

吴茱萸AFLP实验体系的摸索与建立

探讨影响吴茱萸基因组DNA扩增片段长度多态性(AFLP)实验体系的多种因素,建立了一套优化的吴茱萸AFLP分子标记体系。

贵州地区早发性乳腺癌BRCA1基因多态性分析

目的探讨BRCA1基因突变与贵州地区女性早发性乳腺癌的关系。方法收集40岁及40岁以下的贵州地区女性乳腺癌患者外周血55份,同年龄组健康体检者外周血40份,采用聚合酶链反应-单链构像多态性分析(PCR-SSCP)、异源双链分析法(HA)和基因测序,分析BRCA1基因外显子20全长序列和外显子11的部分序列。结果健康对照组未检测出突变,乳腺癌患者组在外显子20未发现突变,仅在外显子11上有1例移框突变,为4184delTCAA,是一个高频致病突变。该突变引起了密码子1354以后的氨基酸框架移位,并在密码子1364形成终止密码,导致蛋白截短。结论外显子11上4184delTCAA与贵州地区早发性乳腺癌可能有一定的关系。

用AFLP分子标记探讨吴茱萸的遗传多样性

用AFLP标记分析研究吴茱萸与其变种石虎和疏毛吴茱萸之间的遗传多样性。采用AFLP技术,从18对引物中筛选出3对引物,对19株不同地域的3种吴茱萸AFLP指纹图谱进行了分析,计算不同品种间的遗传距离和构建吴茱萸的聚类分析树状图。3对引物共扩增出93条带,其中57条(61.3%)呈多态性,吴茱萸种质内遗传距离为0.059～0.765;在相似系数0.48的水平上,19份吴茱萸材料可以大致分为2个类群。吴茱萸不同品种间遗传距离差异较大,遗传分类在一定程度上与传统的分类方法是一致的,这暗示遗传变异与地域分布有相关性。

一种经济、快速的凝胶DNA回收方法

目的:用明胶海绵吸收法回收DNA片段,并验证该方法能否有效、快速的从电泳后琼脂糖凝胶中回收DNA片段。方法:将明胶海绵剪成楔形,在紫外灯照射下插入含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶中,待海绵完全膨胀后取出,离心收集DNA溶液;并用该法回收的DNA片段进行PCR扩增,检验其回收的DNA质量。结果:明胶海绵吸收法回收DNA样品的得率介于63%～98%,所回收的DNA进行PCR扩增能够获得相应的目的条带。结论:明胶海绵吸收法是一种快速、有效的DNA回收方法。

基于ITS区和AFLP的吴茱萸分子鉴定方法(英文)

吴茱萸作为一种重要的中药具有不同的变种,疏毛吴茱萸和石虎。AFLP技术和ITS区测序技术被用于鉴定14株吴茱萸、疏毛吴茱萸和石虎样品。ITS测序发现吴茱萸及其变种具有高度相似性,一致性达97%。在吴茱萸与其变种之间发现有一个SNP位点差异。扩增性片段长度多态性在它们之间具有差异条带。根据上述结果,分子鉴定方法能够用于鉴别吴茱萸及其变种。

仪器法计数血小板的影响因素探讨

为了了解全自动血液分析计数仪的影响因素,本研究用手工法和仪器法分别测定小RBC患者组,大、小PLT患者组及健康对照组的血小板并比较。结果显示小RBC引起仪器法计数血小板测定值假性增高,大、小PLT引起仪器法计数血小板测定值假性降低。另外抗凝剂,标本放置时间,技术操作误差或试剂也是仪器法计数PLT的影响因素。因此,全面了解仪器法计数PLT的影响因素,有助于正确分析血细胞参数。

在分子诊断学教学中培养研究生科研思维能力和创新能力

分子诊断学是临床检验诊断学专业硕士研究生的必修课,为了在这门课程教学中实现对研究生科研思维能力和创新能力的培养。笔者经过不断的探索,对教学内容、教学方法和考试方法等进行改革,初步达到了预期效果。

孕妇外周血中高甲基化RASSF1A基因检测对子痫前期早期预测价值的研究

目的通过分析子痫前期孕妇外周血中胎儿高甲基化RASSF1A基因含量的变化,探讨孕妇外周血中胎儿游离DNA水平在子痫前期中的预测诊断价值。方法收集子痫前期孕妇外周血样本32例,择同期孕龄健康孕妇30例为对照组,采用荧光定量PCR法检测孕妇外周血中高甲基化RASSF1A基因的含量,应用受试者工作特征曲线(ROC)评价高甲基化RASSF1A基因检测对轻度和重度子痫前期孕妇的诊断价值。结果轻度子痫前期组和重度子痫前期组孕妇血浆高甲基化RASSF1A基因的中位数倍值分别是正常妊娠孕妇的3.28倍和10.47倍,有统计学差异(P<0.01);用高甲基化的RASSF1A的1.71MoMs来预测轻度子痫前期,灵敏度为86.4%,特异度为71.2%。结论孕妇血浆中高甲基化的RASSF1A基因含量的变化可以提示子痫前期的发生及病情发展的监测,孕妇血浆胎儿游离DNA可作为一个早期预测孕妇子痫前期的发生的潜在的生物学指标。

量子点荧光免疫渗滤法定量检测血清C反应蛋白的研究

目的：对基于量子点荧光的免疫渗滤快速定量检测血清 C 反应蛋白（CRP）方法进行初步探索，旨在建立一种较好的快速定量检测方法。方法采用双抗夹心法原理在免疫渗滤板上建立自制量子点和量子点-抗体复合物快速免疫检测法，其结果在紫外光照射下进行荧光定性检测。采用激光器和荧光光谱仪相结合的方法，可对荧光检测结果进行定量分析。结果定性检测到 CRP 的最低浓度为0．156 mg/L；定量检测 CRP 浓度范围在0．1～100．0 mg/L 的样本，其检测荧光值与浓度有线性对应关系，线性拟合方程为：log（Y ）＝0．563log（X）＋4．570，r2＝0．958。结论荧光免疫渗透快速定量法可对血清 CRP 进行定量检测；量子点免疫标记技术平台具有开发新型免疫诊断试剂的潜力。

肥胖儿童青少年血清指标表达的影响因素分析

目的探讨肥胖儿童青少年血清锌-α2-糖蛋白(ZAG)、肥胖抑制素(obestatin)及血浆摄食抑制因子(NUCB2/Nesfatin-1)表达水平的影响因素。方法选取2015年2月至2017年1月在上海市奉贤区奉城医院门诊就诊及奉城镇中小学生单纯性肥胖症共125例作为肥胖组,选择同时期在该院体检的正常儿童青少年共90例作为对照组。比较两组的身体质量指数(BMI)、腰臀比(WHR)、体内脂肪百分比(Fat%)、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbAlc)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、Obestatin、ZAG、NUCB2/Nesfatin-1,Obestatin、ZAG、NUCB2/Nesfatin-1,经Spearman相关性分析后进一步做logistic回归分析,分别得出其表达水平的影响因素。结果肥胖组BMI、Fat%、WHR、FBG、HbAlc、HDL-C、LDL-C、TC、TG明显高于对照组(χ~2/t值分别为5.37、7.11、9.10、7.02、5.00、4.60、4.82、3.99、8.21,均P<0.05),但肥胖组ZAG、NUCB2/Nesfatin-1、Obestatin明显低于对照组(t值分别为8.00、6.68、7.19),差异均有统计学意义(均P<0.05)。经Logistic回归分析得到:BMI、WHR是影响ZAG表达水平的独立危险因素,BMI、HDL-C是影响Obestatin表达水平的独立危险因素,BMI、HOMA-IR是影响NUCB2/Nesfatin-1表达水平的独立危险因素。结论肥胖儿童青少年患者血清存在ZAG、Obestatin及NUCB2/Nesfatin-1表达水平的变化,ZAG、Obestatin及NUCB2/Nesfatin-1可能参与了儿童青少年肥胖的发生发展。

孕妇血浆循环DNA的检测与动态分析

目的本文旨在探索使用荧光定量PCR方法对孕妇全血和血浆中DNA含量进行动态分析,从而为利用孕母血浆循环DNA进行无创产前诊断奠定基础。方法提取60例早、中、晚孕期孕妇全血基因组DNA和血浆循环DNA,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术测定不同孕期的孕妇全血和血浆中保守基因(β-actin)的含量,比较不同孕期孕妇全血和血浆DNA含量的变化。结果 (1)早、中、晚孕期孕妇全血DNA含量Ct平均值为18.44±0.56828、18.35±0.93394、18.15±0.57410,3组比较没有显著性差异(P>0.05);(2)孕妇早、中、晚期孕组血浆DNA含量Ct平均值25.59±1.17673、25.50±1.59892、24.35±2.24301,早、中期孕组血浆DNA没有显著性差异(P>0.05),早、晚期和中、晚期孕组血浆DNA在两者之间有显著性差异(P<0.05);(3)排除全血DNA干扰,早、中、晚孕期孕妇血浆中DNA相对定量值为0.007401、0.007401、0.013602。结论用实时荧光定量PCR的方法可以检测到孕妇血浆中循环DNA的含量变化,随孕周的增加而逐渐增加,可以利用其进行无创产前诊断。

两种提取孕妇血浆游离胎儿DNA方法的比较

目的分别应用两种方法进行血浆游离胎儿DNA的提取,判定及筛选最佳的血浆游离胎儿DNA的提取方法,为后续试验提取游离胎儿DNA的方法提供参考依据。方法收集30例健康妊娠孕妇血浆,用离心柱法和磁珠法进行血浆游离DNA的提取,经甲基化敏感限制性内切酶Bst UI酶切后使用微量紫外分光光度计测量所提取的游离胎儿DNA的含量及纯度,再使用实时荧光定量PCR扩增方法测定扩增效率,进行统计学分析。结果离心柱法所提取的游离胎儿DNA的测定结果为:含量(43. 27±21. 01) ng/μl;纯度A260/A280 (0. 999 7±0. 084 42);扩增效率为94%;而磁珠法提取的游离胎儿DNA的测定结果为:含量(31. 74±12. 25) ng/μl:纯度A260/A280 (0. 878 3±0. 052 66);扩增效率为87%。两组方法提取游离DNA的浓度、纯度比较,差异有统计学意义(均P<0. 05)。结论离心柱法比磁珠法操作更简便、快捷。经测定提取的DNA的浓度及纯度,扩增效率后可判断离心柱法所提取的游离胎儿DNA的浓度、纯度及扩增效率都远远优于磁珠法;离心柱法比磁珠法更适用于后续无创产前诊断研究试验。

妊娠各期母血中胎儿RASSF1A基因含量的测定

目的本文旨在分析确定妊娠早、中、晚各期母血中胎儿DNA的含量,从而为利用孕母血浆循环DNA进行病理性妊娠诊断研究奠定基础。方法收集746例不同孕期孕妇抗凝血,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术测定高甲基化RASSF1A基因含量,确定不同孕期孕周孕妇外周血浆中胎儿DNA含量。结果孕妇早、中、晚期孕组血浆胎儿DNA平均含量分别34.68±24.76copies/μL、204.03±124.91copies/μL、338.84±345.15 copies/μL,三组比较有显著性差异(P<0.05)。孕妇血浆中的高甲基化RASSF1A水平随着孕周的增长而增高。最早可在7周检测到孕妇血浆中高甲基化RASSF1A基因,含量随妊娠的进程逐渐增加,且在分娩后三天内消失。10例健康未妊娠女性血浆均未检出高甲基化RASSF1A基因。结论用实时荧光定量PCR的方法可确定正常孕妇血浆中不同孕期孕周胎儿DNA的含量,为后续病理性妊娠诊断研究提供实验依据。