水牛bFGF基因的克隆、逆转录病毒载体的构建和鉴定

对水牛碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因进行克隆、序列分析,构建bFGF表达载体,为其在水牛干细胞中的功能研究奠定基础。以水牛胎儿组织为材料提取总RNA,利用逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)克隆得到的bFGF基因编码区序列,进行生物信息学分析,构建表达bFGF的逆转录病毒载体(pMXs-bFGF-IRESGFP),并在293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibroblast,BFF)上进行重组载体表达鉴定。结果表明,水牛bFGF基因编码区全长468bp,编码155个氨基酸,含有纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族特有的蛋白结构;逆转录病毒载体介导的bFGF基因能在293T细胞和BFF中表达。本研究克隆出水牛bFGF编码序列,构建的逆转录病毒载体能在不同真核细胞中表达bFGF。

CHRNG基因新发变异致多发性翼状胬肉综合征1例的遗传学分析

目的探讨1例多发性翼状胬肉综合征(MPS)患儿的临床特征及遗传学病因。方法选取2020年8月19日于广州市妇女儿童医疗中心骨科就诊的1例MPS患儿作为研究对象。收集患儿的临床资料,采集患儿及其父母的外周血样,对患儿进行全外显子组测序(WES),用Sanger测序对候选变异进行家系验证,并进行生物信息学分析。结果患儿为女性,11岁,因"发现脊柱侧弯8年,加重伴双肩不等高1年"就诊。WES检测结果提示其携带CHRNG基因c.55+1G>C纯合剪接变异,Sanger测序证实其父母均携带CHRNG基因c.55+1G>C杂合剪接变异。生物信息学分析:CHRNG基因c.55+1G>C变异在CNKI、万方数据知识服务平台及HGMG等数据库中均未见收录。经Multain在线软件分析,该位点所编码的氨基酸在不同物种中高度保守。经CRYP-SKIP在线软件预测,该变异导致第1外显子潜在剪接位点激活与跳跃的概率分别为0.30与0.70。确诊患儿罹患MPS。结论CHRNG基因c.55+1G>C变异可能是本研究MPS患儿的遗传学病因。

家兔DEPTOR基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与验证

为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明:用构建的过表达载体pEGFP-DEPTOR和pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1转染HEK 293T细胞后均能观察到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR能扩增出相应条带,即慢病毒感染法能成功将DEPTOR基因转入细胞内。构建的shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508能有效降低DEPTOR基因的表达,与未干扰相比差异显著(P<0.05),干扰效率约为80%。说明试验成功构建出DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体。