传染性法氏囊病病毒和禽致病性大肠杆菌的二重探针实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立用于传染性法氏囊病病毒(IBDV)和禽致病性大肠杆菌混合感染快速鉴别检测的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,研究分别根据IBDV VP2基因和大肠杆菌UidA基因设计合成特异性引物和探针,通过普通PCR方法扩增目的基因片段并克隆至pGM-T载体,构建重组质粒pGM-T/VP2和pGM-T/UidA作为标准品,通过正交试验确定引物和探针的最佳浓度,分别建立基于VP2和UidA基因的标准扩增曲线,并进一步验证其特异性、灵敏性、重复性,建立的方法应用于人工感染样本和临床样本的检测,并与常规PCR方法进行比较。结果显示:VP2和UidA基因的最佳上、下游引物浓度均为0.30μmol/L,VP2和UidA基因的探针浓度分别为0.35μmol/L和0.25μmol/L;VP2和UidA基因扩增的线性范围均为10^(3)~10^(7)拷贝/μL,相关系数R2≥0.99,灵敏度均为100拷贝/μL;两者组间及组内变异系数均小于2%;人工感染样品与临床样品的检测结果与普通PCR方法一致。研究表明,建立的二重探针FQ-PCR方法为同时检测IBDV和禽致病性大肠杆菌提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。