金荞麦苯丙氨酸解氨酶基因FdPAL的克隆及原核表达

目的:克隆金荞麦苯丙氨酸解氨酶(FdPAL)基因DNA和全长cDNA序列,对该基因进行序列分析,原核表达及其活性相关研究。方法:采用同源克隆和RT-PCR技术扩增苯丙氨酸解氨酶基因的DNA序列和全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析;构建PAL原核表达载体pET30b(+)-FdPAL,在大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)中进行诱导表达,使用分光光度计法定量测定其酶活,使用薄层色谱法鉴定其催化活性。结果:金荞麦PAL基因DNA序列全长2 583 bp,由2个外显子,1个内含子构成(命名为FdPAL,GenBank登录号为HM628904);cDNA序列包含1个2 169 bp的开放阅读框(ORF),编码722个氨基酸,理论相对标准分子质量78.31 kDa,等电点5.94。SDS-PAGE分析表明,诱导后的新生蛋白质相对标准分子质量为75.37 kDa;诱导4 h后,表达产物的苯丙氨酸解氨酶比活力最高,达到4 386 nmol.g-1.min-1;薄层色谱结果表明,诱导表达产物具有催化苯丙氨酸转化为肉桂酸的活性。结论:首次从金荞麦中克隆到PAL基因,该基因具有植物PAL同源基因的典型特征;重组的金荞麦PAL基因表达载体[pET30b(+)-FdPAL]能有效地在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,并形成具有一定催化功能的酶。