nr1h4调控转基因斑马鱼模型建立及相关研究

目的建立法尼醇X受体(FXR,基因名称nr1h4)组织特异性荧光标记转基因斑马鱼模型,为胆汁酸代谢相关药物筛选及安全预警提供可视化检测动物模型。方法在UCSC网站查找斑马鱼nr1h4基因调控序列,并利用Promoter 2.0软件对其进行优化,设计引物,利用PCR方法调取斑马鱼nr1h4调控序列,构建于pT2AL200R150G转座载体克隆位点,将pTol2-nr1h4-EGFP质粒与pCS-TP转座酶mRNA共同注入斑马鱼受精卵单细胞,筛选出在肝脏和肠道中特异性表达的荧光个体,通过遗传学筛选,建立Tg(-1.6nr1h4-EGFP)斑马鱼品系。将受精后第4天的Tg(-1.6nr1h4-EGFP)斑马鱼幼鱼随机分为空白对照组、溶媒对照组、甘氨酸-β-鼠胆酸组、奥贝胆酸组以及低、中、高浓度(10、20、40μg·mL)熊去氧胆酸组、胆宁片组、大黄酸组和芦荟大黄素组,连续给药4 d,观察各组转基因斑马鱼不同时间的荧光强度及发育情况,并对荧光强度进行分析。结果成功建立了Tg(-1.6nr1h4-EGFP)荧光标记转基因斑马鱼品系,绿色荧光于体节期开始在斑马鱼腹部表达,受精后第4天(4dpf)主要集中在肝脏和肠道表达。与空白对照组相比,甘氨酸-β-鼠胆酸组转基因斑马鱼在各给药时间的荧光表达水平均显著降低(4dpf:P<0.01;5~7dpf:P<0.0001),奥贝胆酸组在各给药时间荧光均显著增强(P<0.0001),溶媒组荧光表达水平与对照组无显著差异,表明了该模型的有效建立。与空白对照组相比,低浓度的熊去氧胆酸组和芦荟大黄素组转基因斑马鱼在给药第2~4天荧光表达水平逐渐增强(P<0.0001),中浓度的熊去氧胆酸组和芦荟大黄素组在各给药时间荧光均显著增强(P<0.0001),高浓度的芦荟大黄素组在给药第2~4天荧光逐渐增强(5~6dpf:P<0.001;7dpf:P<0.05),高浓度的熊去氧胆酸组荧光表达水平与空白组无显著差异;低浓度的胆宁片组和大黄酸组转基因斑马鱼在各给药时间的荧光表达水平与空白组无显著差异,中浓度的胆宁片组在各给药时间荧光均显著增强(4dpf和7dpf:P<0.0001;5dpf和6dpf:P<0.001),高浓度的胆宁片组在各给药时间荧光依旧显著增强(P<0.0001),中浓度的大黄酸组在给药第2~4天荧光逐渐增强(5dpf:P<0.0001;6dpf:P<0.001;7dpf:P<0.01),而高浓度的大黄酸组在给药第2~4天荧光开始减弱(P<0.0001)。结论Tg(-1.6nr1h4-EGFP)斑马鱼模型为胆汁酸药物机制研究、药物筛选和安全性评价提供了新的动物模型;低、中浓度的熊去氧胆酸,中、高浓度的胆宁片,中浓度的大黄酸和各浓度的芦荟大黄素均能够通过上调斑马鱼肝脏和肠道FXR促进胆汁酸转运,而高浓度的熊去氧胆酸对FXR无明显作用,高浓度的大黄酸抑制FXR表达。

影响斑马鱼幼鱼心脏发育和运动行为的囊胚期暴露二甲亚砜浓度探讨

目的探讨影响斑马鱼幼鱼心脏发育和运动行为的二甲亚砜(DMSO)浓度。方法受精后4 h斑马鱼囊胚暴露含终浓度(V/V)为0.15%,0.30%,0.45%和0.60%DMSO的E3孵化液中,持续6 d。用Noldus斑马鱼幼鱼行为学分析系统,于暴露2,3和4 d,记录胚胎和幼鱼心率;暴露6 d进行行为学实验,检测幼鱼游动时间、游动速度、游动距离和游动频次;暴露2,4和6 d,RT-PCR检测心脏发育相关基因心房特异性肌球蛋白重链(amhc)和心室特异性肌球蛋白重链(vmhc)基因及运动相关基因谷氨酸脱羧酶1b(gad1b),γ氨基丁酸A型受体亚基α1(gabra1)和γ氨基丁酸转氨酶(abat)mRNA表达水平。结果与正常对照组相比,0.3%~0.60%DMSO对胚胎(暴露2 d)心率无影响;幼鱼(暴露4 d)心率显著降低(P<0.05,P<0.01)。行为学实验结果显示,与正常对照组相比,暴露6 d,0.3%~0.60%DMSO组幼鱼游动时间、游动速度、游动距离和游动频次显著下降(P<0.05)。RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,暴露2 d,仅0.60%DMSO组胚胎vmhc mRNA表达水平显著降低(P<0.05),DMSO 0.15%~0.60%组gad1b mRNA表达水平均显著降低(P<0.01),仅0.45%DMSO组gabra1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),0.15%DMSO组abat mRNA表达水平显著上调(P<0.01),而DMSO 0.45%和0.60%组显著下调(P<0.01);暴露4 d,0.15%~0.60%DMSO组gad1b,gabra1和abat mRNA表达水平均显著下降(P<0.01);暴露6 d,0.15%~0.60%DMSO组gad1b mRNA表达水平均显著下降(P<0.01),abat mRNA表达水平显著上调(P<0.01),0.60%DMSO组gabra1 mRNA表达水平显著上调(P<0.01)。结论DMSO浓度≥0.3%,持续暴露6 d,对斑马鱼心率、运动行为、心脏发育相关基因和运动相关基因表达有影响。