草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征

采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。

草鱼APN基因的克隆及表达特征

氨肽酶N(APN)是肽酶M1家族的成员之一,在蛋白质的消化中发挥重要作用。采用同源克隆和RACE技术首次克隆草鱼APN基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为3258bp,包含27bp的5UTR序列,552bp的3UTR序列,2679bp开放阅读框,编码892个氨基酸;草鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为81.5%和75.4%,与其他动物同源性分别为58.8%～61.2%和54.3%～60.2%。经预测,其编码蛋白的分子量为100.61ku,等电点为5.14,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的1个螺旋跨膜结构,但跨膜区氨基酸同源性较低;系统进化分析表明,草鱼APN基因与斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-timePCR技术检测了该基因的发育表达,结果显示草鱼出膜4d后APNmRNA表达量相对稳定;APN在草鱼前肠、中肠和后肠均有较高的表达量,以前肠组织表达量最高;昼夜节律研究发现,肠道APN基因06:00-18:00的表达量较18:00-06:00高。

膳食纤维及其在可食性包装中的应用

通过对膳食纤维的物化特性和生理功能的介绍,以及对可食性包装的简述,探讨膳食纤维在可食性包装方面的研究现状及前景。

膳食纤维的功能特性及在饲料中的应用前景

随着人们养殖观念的提升及对养殖产品品质要求的提高,采用新型的养殖饲料配方,成为养殖业发展的一个新趋势。膳食纤维被称为人类第七营养素,有多种对人体和动物有益的保健功能,适量摄入对改变肠道的微生物群系组成、清除肠道的有害物质、对有机物和金属离子具有吸附螯合作用等具有重要意义。以膳食纤维作为饲料添加材料,不仅可充分利用资源、降低环境污染,还可发挥其优异的生理功能。本文通过对膳食纤维的功能特性的介绍,探讨了膳食纤维在饲料添加剂的研究现状及应用前景。

丁酸钠对湘云鲫蛋白质代谢及其相关基因表达的影响

本试验旨在研究丁酸钠对湘云鲫蛋白质代谢及其相关基因表达的影响.试验在室内养殖系统中进行,将450尾初始体质量为（6.02±0.16）g的湘云鲫随机分为5组（每组设3个重复,每个重复30尾）,分别饲喂在基础饲料中添加0（对照）、1.0、2.5、5.0和7.5 g/kg丁酸钠（30％微囊包膜丁酸钠）的等氮等能试验饲料,试验持续7周.结果表明：饲料中添加1.0～7.5 g/kg丁酸钠显著提高了湘云鲫血清总蛋白、白蛋白、球蛋白的含量（P＜0.05）;亦提高了血清白球比、谷草转氨酶活性和葡萄糖含量,但仅2.5和5.0g/kg丁酸钠组的血清白球比、2.5 g/kg丁酸钠组的血清谷草转氨酶活性和5.0 g/kg丁酸钠组的血清葡萄糖含量与对照组相比达到了显著水平（P＜0.05）.与对照组相比,各添加组血清游离非必需氨基酸含量有增有减,变化规律不明显.随着丁酸钠添加水平的增加,血清中其他游离必需氨基酸基本上都表现为先增加后降低,在丁酸钠添加水平为2.5 g/kg时达到最高,而唯独赖氨酸表现为持续下降.与对照组相比,1.0和2.5 g/kg丁酸钠组肠道氨肽酶N（APⅣ）基因的相对表达量显著降低（P＜0.05）,2.5、5.0和7.5丁酸钠组肠道谷氨酸脱氢酶（GDH）基因的相对表达量显著升高（P＜0.05）.上述结果表明,饲料中添加适量的丁酸钠可提高湘云鲫的蛋白质代谢水平及其相关基因的表达,结合生长指标和生产成本,推荐添加剂量为2.5 g/kg.

营养素转运载体的研究进展

大分子的营养物质,如:蛋白质、糖类和脂肪等,被动物体摄入后都要经过一系列蛋白酶消化成小分子营养物质,这些小分子的营养物质再被肠道及其他组织中相应的转运载体转运到细胞内后才能被机体利用。综述肠道内小肽转运载体、氨基酸转运载体和葡萄糖转运载体的成员和分类,介绍其结构特征、功能特性及组织分布;并简单阐述肠道内这3类营养素转运载体基因表达的影响因素。

微核检测方法的比较研究

本文对小鼠骨髓微核检测方法进行了对比研究。结果证明,首先在选用材料方面,股骨比胸骨好;其次在收集骨髓细胞时,冲洗骨髓腔比用止血钳挤出骨髓液取材要好;再者在选用染色方法方面,用普通的Giemsa染色比用荧光染色观察起来方便,且效果也很好。经统计学分析,实验组和阴性对照组的微核发生率分别为(7.5±1.34)‰和(2.9±0.38)‰,两组间有极显著差异(P<0.01)。

水产动物营养基因组学的研究进展

近年来，基因组学和生物信息学在生物技术领域中的研究获得了巨大进展。在营养学领域研究营养素与基因相互作用下，营养基因组学迅速发展成为营养学研究的热点。营养基因组学涵盖了一个广泛的领域，它研究营养素和基因表达的相互影响，预测其对营养素的反应。是利用基因组学研究成果及方法技术来发现与营养的合成、积累、吸收、转运及代谢等有关基因的综合方法。本文重点介绍了水产营养基因组学的研究与应用的现状，并对今后的研究趋势作了进一步的展望。

凝结芽孢杆菌对镉暴露下鲤肝脏镉含量、抗氧化能力及炎症反应的影响

为了探究凝结芽孢杆菌SCC-19对镉暴露下鲤肝脏镉含量、抗氧化能力以及炎症反应的影响,实验选取平均体重为(34.00±1.16)g的鲤450尾,随机分为5组(每组3个重复,每个重复30尾),即对照组、0.5 mg/L Cd^(2+)组、0.5 mg/L Cd^(2+)+10^(7)CFU/g凝结芽孢杆菌组,0.5 mg/L Cd^(2+)+10^(8)CFU/g凝结芽孢杆菌组以及0.5 mg/L Cd^(2+)+10^(9)CFU/g凝结芽孢杆菌组(分别记为DK、D、DA、DB和DC),养殖8周。结果显示,与镉暴露组相比,凝结芽孢杆菌SCC-19能够有效降低鲤肝脏中镉含量,显著提高金属硫蛋白(MT)的水平,降低血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性。此外,凝结芽孢杆菌组鲤肝脏总抗氧化能力(TAOC)、抗超氧阴离子自由基能力(ASA)和抑制羟自由基能力(AHA)水平显著高于镉暴露组,而活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)水平显著低于镉暴露组。另外,凝结芽孢杆菌SCC-19可以恢复鲤肝脏因镉暴露造成的肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-1β)、转化生长因子-β(TGF-β)等基因的异常表达。研究表明,凝结芽孢杆菌SCC-19可以减少镉暴露下鲤肝脏镉含量,缓解氧化应激,抑制炎症反应。研究结果有助于探索凝结芽孢杆菌做为饲料添加剂缓解水产动物镉毒性的可能性。

椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21甘露聚糖酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

为了提高β-甘露聚糖酶的活性及稳定性,通过基因克隆技术克隆并表达了一株分离自椰果的内生枯草芽孢杆菌YZ-21(Bacillus subtilis YZ-21)β-甘露聚糖酶基因ManA,并使用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定了酶活性及稳定性。结果表明:β-甘露聚糖酶基因ManA序列全长1104 bp,与相同来源的β-甘露聚糖酶同源性高达97.56%,具有ManA保守结构域,符合糖苷水解酶家族GH26的典型特征。将ManA连接到pET-32a表达载体上,构建重组表达质粒pET-ManA,并导入大肠杆菌BL21(DE),经诱导获得了β-甘露聚糖酶基因ManA的高效表达。表达产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳分析,显示条带大小约为56.07 ku。重组酶活性为372.86 U/mL,酶学性质研究发现其最适反应温度为40℃,最适pH为7.0,最佳反应底物是瓜豆胶,酶活性能够达到392.54 U/mL。在55℃处理120 min后,酶活仍保留69.8%,pH为4.0~9.0时处理30 min后酶活性均能保留60%以上,且金属离子Ca^(2+)、Co^(2+)、Ba^(2+)对重组酶有明显激活作用。综上所述,从内生枯草芽孢杆菌YZ-21中克隆的β-甘露聚糖酶基因能在大肠杆菌中高效表达,并具有良好的稳定性。

尖齿胡鲶特殊器官——腹腔外肝

在进行尖齿胡鲶Clarias gariepinus解剖实验时,发现除了正常的体腔内肝脏外,其左右两叶还向腹腔两侧壁延伸,在胸鳍后方形成一特殊器官——腹腔外肝。经多个样本解剖证明这一组织并非畸形,腹腔外肝的组织学结构与腹腔内肝脏本体基本一致,表明这一特殊器官为肝脏组织。经查阅文献,在其他鲇形目Siluriformes鱼类的体内也发现腹腔外肝,表明这一器官应为鲇形目部分类群所特有。

鲤源高黏附力地衣芽孢杆菌HF-07107分离及其益生菌特性研究

【目的】分离、鉴定鲤源高黏附力地衣孢杆菌菌株,并综合评价其作为鲤养殖饲料添加剂的潜力,为开发宿主源益生菌在鲤养殖中的应用提供参考。【方法】从健康鲤的肠道及其内容物中分离出潜在益生菌,根据形态学特征、生理生化特性、16S rRNA序列比对分析、菌株系统发育进化树构建等对分离菌株进行鉴定。通过检测分离菌株的自聚集能力、共聚集能力及其在有机溶剂中的疏水性评估其黏附能力,并通过测定菌株的耐酸、耐胆盐和耐高温能力,对嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力及对抗生素药敏片的敏感性,明确其是否具有益生菌特性。【结果】从健康鲤的肠道及其内容物中分离出菌株HF-07107,形态学特征显示该菌株能产生芽孢、呈革兰氏阳性、杆状,其生理生化特征与地衣芽孢杆菌一致,其16S rRNA序列与地衣芽孢杆菌ATCC 14580T相似性为99.31%,且与地衣芽孢杆菌聚类在同一分支上,综合鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌。菌株HF-07107自聚集能力最高达72.92%,与迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的共聚集能力分别为96.15%和60.23%,在有机溶剂甲苯、二甲苯、三氯甲烷、正己烷中的疏水性值较高(90.00%以上),说明菌株HF-07107有高黏附力。同时,菌株HF-07107能耐受pH 2.0、0.3%胆盐浓度和90℃高温环境,抑制嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长,对复方新诺明、丁胺卡那、环丙沙星、庆大霉素、红霉素、四环素、头孢唑林和诺氟沙星等8种抗生素敏感。【结论】鲤源潜在益生菌地衣芽孢杆菌HF-07107具有高黏附特性,能耐受不良环境,抑制病原菌生长,可作为宿主源益生菌应用于水产养殖。

鲤细胞因子多克隆抗体的制备及检测

为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。

微生物β-甘露聚糖酶的研究进展

β-1,4-D-甘露聚糖酶是一种广谱诱导型多功能酶,广泛存在于植物、动物和微生物中,其主要存在于微生物中,主要水解产物为甘露寡糖。该文对β-甘露聚糖酶的来源、酶结构、催化机制及过去和现在的应用进行了综述,并对β-甘露聚糖酶在动物生产、饲料、食品、医药、石油开采及生物技术等方面的广泛应用进行介绍,为β-甘露聚糖酶的基础研究和开发提供参考和依据。

产酸芽孢杆菌的筛选与生物学特性研究

使用改良MRS培养基从养殖池塘底泥中分离得到一株具有产酸能力的芽孢杆菌,命名为DN-5.通过形态观察,生理生化指标测定,扫描电镜观察,16S rDNA同源序列比对和gyrB基因及系统发育树分析,确定该菌株为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralichiformis).对该菌株发酵液中的代谢产物进行气相-质谱分析,发现DN-5可产生丁酸、丙酸和乙酸等短链脂肪酸.生物学特性研究表明,DN-5对嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)、大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均有良好的抑制作用,抑菌圈直径分别达17.40 mm、9.77 mm和21.03 mm.同时,对菌株DN-5进行耐热、耐酸和耐胆盐处理,发现DN-5具有较强的耐热性能和良好的耐酸、耐胆盐能力.对庆大霉素、链霉素、氨苄青霉素等抗生素均表现为敏感(S).DN-5既具有乳酸菌产酸的特性,又具有芽孢杆菌的优势,且具有很好的安全性,在水产养殖中具有广阔的应用前景.

基于转录组测序技术筛选花■卵巢发育相关基因

为筛选影响花[鱼骨]卵巢发育相关的基因,采用Illumina Hiseq技术对花[鱼骨]脑、卵巢和肝脏组织进行高通量转录组测序。结果显示,3个组织分别产生了49 484 132、47 540 538和50 622 304个clean reads,组装后共获得了99 878个unigenes,平均长度为1 430 bp。DE seq分析发现,在脑vs.卵巢组中特异性表达的基因数为2 305个,脑vs.肝脏组中特异性表达的基因数为839个,卵巢vs.肝脏组中特异性表达的基因数为1 474个,3个比较组共有的差异表达基因数为860个。GO分析发现,上述差异表达基因主要集中在初级代谢过程(primary metabolic process)、单细胞过程(single-organism process)、有机物代谢过程(organic substance metabolic process)等生物学过程中。KEGG pathway分析显示,一些与卵巢发育和减数分裂相关的信号通路得到了显著富集,如GnRH信号通路、类固醇激素合成、TGF-β信号通路、卵母细胞减数分裂等代谢通路。本研究结果丰富了花[鱼骨]的基因资源,可为花[鱼骨]的繁殖生物学研究提供基础数据。

椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21产β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质研究

[目的]分离纯化来源于内生枯草芽孢杆菌YZ-21的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质.[方法]采用乙醇沉淀法、硫酸铵盐析法、聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH 4)2SO 4]双水相体系进行分离与纯化,在此基础研究它的酶学性质.[结果]比较3种纯化方法,最优方法为双水相萃取法,在双水相体系为16%(NH 4)2SO 4、18%PEG2000、2%NaCl条件下,纯化倍数最高可以达到3.06,酶回收率达到99.26%;酶学性质研究表明,β-甘露聚糖酶的最适反应pH为7.0,最适的反应温度是40℃,pH稳定性在3.0~7.0,热稳定范围在35~55℃之间;Ca^2+,Ba^2+,Mg^2+,K^+,Co^2+对酶都有激活作用,而Ca^2+激活作用最强,Cu^2+,Na^+,Zn^2+,Mn^2+,EDTA对酶有抑制作用.[结论]利用双水相萃取法较好纯化了β-甘露聚糖酶,酶学性质良好,可以广泛应用于饲料添加剂、纸浆漂白和食品加工等领域.

基于宏基因组学研究怀地黄对鲤鱼肠道微生物群落组成的影响

鲤鱼(Cyprinus carpio L.)是我国淡水养殖鱼类的主要品种之一,其养殖过程中病害给养殖业带来重大经济损失.已有研究表明怀地黄(Rehmannia glutinosa,RG)作为饲料添加剂,具有提高鲤鱼免疫力和抵抗病害的功能,但机制尚不明确.利用宏基因组技术研究饲料中添加4%(质量分数)怀地黄对鲤肠道微生物群落组成的影响.结果表明梭杆菌门(Fusobacteria),变形杆菌门(Proteobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),广古菌门(Euryarchaeota),奇古菌门(Thaumarchaeota),短尾噬菌体(Siphoviridae),肌尾噬菌体(Myoviridae),长尾噬菌体(Podoviridae),子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)是鲤肠道主要微生物类群.怀地黄可以增加鲤鱼肠道中益生菌、短链脂肪酸产生菌和产甲烷古菌的丰度,同时降低一些鱼类病毒的丰度.研究结果表明,饲料中添加怀地黄可以改善鲤鱼肠道微生物组成,提高有益菌的丰度而降低有害微生物的含量.研究结果为解析怀地黄增强鲤鱼免疫力的机制奠定了基础.

葡甘聚糖酶高产菌株Bacillus subtilis的超剂量诱变育种

超剂量诱变育种就是加大诱变剂处理剂量,提高菌株突变幅度,从而获得较好的诱变效果.以葡甘聚糖酶产生菌Bacillus subtilis MY-1为初始菌株,先用紫外线、硫酸二乙酯进行单因子诱变,再用超剂量复合诱变,经过透明圈法和摇瓶筛选,得到了一株高产葡甘聚糖酶的突变菌株,命名为Bacillus subtilis UDMY-25,连续传代培养5次,发酵酶活稳定在5 387.2U/mL以上,较原初始菌株提高了44.8%,该菌株产酶能力处于同领域较高水平,具有较好的开发潜力和市场应用价值.

乳酸乳球菌Z-2不同处理方式对鲤益生作用的离体研究

为探究乳酸乳球菌Z-2(Lactococcus lactis Z-2)不同处理方式对鲤的益生作用,试验共设置L.lactis Z-2菌株6种不同处理[活菌及上清液的混合物(mixture of live cells and supernatant,LCS)、无细菌培养上清液(cell-free culture supernatant,CS)、活菌(live cells,LC)、菌热灭活(heat-killed cells,HK)、菌超声破碎(ultrasonic broken of cells,UB)和胞外多糖(exopolysaccharides of CS,EPS-2)]与鲤[体重(47.66±0.43)g]头肾单核细胞体外共培养,检测其对鲤头肾单核细胞的增殖能力和吞噬活性,及孵育液中一氧化氮(NO)和免疫相关细胞因子表达量的影响。结果表明:LCS、LC、UB和EPS-2处理组较之对照组,均能显著增强头肾细胞的增殖能力和吞噬活性,HK处理组仅能显著增强头肾细胞的吞噬活性(P<0.05),其中LC(1.580±0.032)和LCS(1.520±0.058)分别对鲤头肾细胞增殖能力和吞噬活性具有最积极的促进作用。除CS组外,其余处理组均能显著提高孵育液中NO的合成量(P<0.05),EPS-2[(1.960±0.043)μmol/L]效果最为显著。所有处理组均能显著增加头肾细胞中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β的合成量(P<0.05),并且分别是LCS[(23.11±1.31)pg/mL]、HK[(991.82±55.86)pg/mL]、LCS[(147.98±8.25)pg/mL]/CS[(147.38±7.94)pg/mL]和LCS[(139.56±9.69)pg/mL]处理组具有最佳的促进效果;而仅有LCS、CS和EPS-2处理组能显著提升IL-10的合成量(P<0.05),且LCS[(81.82±3.03)pg/mL]具有最佳的促进效果。研究表明,L.lactis Z-2的不同处理方式均对鲤表现出一定的免疫调节作用。