课程思政融入“基础医学实验技术”的教学内容设计

“基础医学实验技术”是高等医学教育的重要组成部分。基于此课程实践性强,强调夯实基本的实验操作技能的特点,教学团队结合课程思政理念,落实党的教育方针,充分挖掘课程教学内容中的思政元素,设计融有安全意识、尊重生命、科学精神、社会责任感等元素的教学内容。为进一步实现培养操作能力强、综合素质高的应用型、研究型和复合型医学人才的目标奠定实践基础。

弓形虫病诊断方法研究进展

弓形虫病是由弓形虫感染引起的一种严重的人兽共患寄生虫病,对人类健康造成极大威胁。本文对弓形虫病诊断技术,包括不依赖DNA检测诊断方法、血清学检测以及基于寄生虫核酸的分子生物学方法进行综述,为弓形虫病诊断技术和方法的发展提供新的思路。

开展“线上线下”混合式教学的意义探讨

基础医学教育是临床医学教育不可或缺的重要组成部分,其中基础医学实验是实现理论与实践结合,培养学生科研素养的重要支撑。通过针对临床医学专业大一新生实验技能调研,认真分析学生科研诉求,合理开展基础医学实验技术“线上下线”混合式教学,提升学生自主学习能力,培养合格临床医学人才。

绿色建筑工程技术的发展运用分析

目前,随着社会的快速发展,我国的基础性设施建设不断地增多,都融入了绿色的理念。在现代化建筑发展中,绿色建筑的数量和规模有所扩大。建筑产业属于消耗量较大的产业之一,同时也造成了环境污染,因此作为建筑行业来说,要高度的重视绿色建筑理念,更好的融入到建筑施工技术中。本文将分析绿色建筑的概念,同时阐述在绿色建筑工程技术中存在的问题,并提出针对性的解决措施。

基于AMPK/mTOR自噬通路探讨芍药苷保护溃疡性结肠炎小鼠的作用机制

目的:探讨芍药苷通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬通路对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的保护作用机制研究。方法:自由饮用4%葡聚糖硫酸钠(DSS)建立UC小鼠模型,56只BALB/c雄性小鼠,随机分为模型组、AMPK抑制剂组(20 mg·kg^(-1))、芍药苷(50 mg·kg^(-1))+抑制剂(20 mg·kg^(-1))组、芍药苷高剂量组(50 mg·kg^(-1))、中剂量组(25 mg·kg^(-1))、低剂量组(12.5 mg·kg^(-1))药物干预7 d后,通过比较小鼠体质量、疾病活动指数(DAI)变化和苏木素-伊红(HE)染色结果判断芍药苷对UC的保护作用。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的水平,免疫荧光检测结肠中微管相关蛋白1轻链3(LC3)的含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结肠组织中AMPK、mTOR蛋白及其磷酸化蛋白p-AMPK、p-mTOR,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测AMPK、mTOR、Beclin1、LC3和p62的mRNA表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠体质量下降、DAI评分升高、结肠出现严重的病理学损伤,炎症因子TNF-α、IL-6在血清中含量上升(P<0.01),LC3和p-AMPK/AMPK在结肠组织中蛋白水平下调,p-mTOR/mTOR蛋白水平上调(P<0.01);AMPK、LC3的mRNA表达水平下调,mTOR、p62的mRNA表达上调(P<0.01)。与模型组和芍药苷+抑制剂组比较,经芍药苷治疗后小鼠体质量上升、DAI评分降低、结肠组织病理损伤减轻,炎症因子TNF-α、IL-6在血清中含量下降(P<0.05),LC3和p-AMPK/AMPK在结肠组织中蛋白水平上调,p-mTOR/mTOR蛋白水平下调(P<0.01),AMPK、Beclin1、LC3的mRNA表达水平上调,mTOR、p62的mRNA表达下调(P<0.01),抑制剂组小鼠结肠组织病理损伤严重,各项指标趋势与芍药苷高剂量组完全相反。结论:芍药苷可通过激活AMPK/mTOR信号通路,增强自噬,减轻UC小鼠的炎症损伤,从而起到保护作用。

BCSP31蛋白双抗夹心ELISA定量方法的建立及应用

通过原核表达系统制备、纯化布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗核心组分BCSP31蛋白,并将其作为免疫原及标准品分别免疫新西兰大白兔(1mg/只)和BALB/c鼠(200μg/只)制备兔源捕获多克隆抗体和鼠源检测多克隆抗体,对双抗夹心ELISA方法的捕获抗体和检测抗体最佳稀释倍数、封闭液种类及封闭条件、酶标二抗工作条件等参数进行优化,结果显示兔多克隆抗体最佳包被浓度和鼠多克隆抗体最佳稀释倍数均为1∶1600、3%脱脂奶粉封闭1h、酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4000、酶标二抗孵育时间1h、显色时间为15min的条件下建立的双抗夹心ELISA方法效果最好。按照上述最佳反应条件对布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗(BCSP31-cVLPs)核心抗原成分BCSP31蛋白进行定量检测,并对其敏感性、特异性、重复性等性能进行评价,结果显示1μL布鲁菌嵌合病毒样颗粒中的BCSP31含量约占总蛋白含量的14.187%;将布鲁菌嵌合病毒样颗粒稀释640倍后,P/N值仍大于2.1,有较高的敏感性;与FAdV、IBDV、NDV、AIV等其他病毒样颗粒均无交叉反应,特异性高;批间和批内变异系数均在10%以下,重复性良好。该方法的建立为推进布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗的质量控制标准建立及商品化奠定了基础。

“新流腺”三联嵌合型病毒样颗粒疫苗的免疫效果评价

为了评价“新流腺”三联嵌合型病毒样颗粒(ND-AI-FAdV4 cVLPs)的免疫保护效果,本试验将其定量免疫至7日龄SPF雏鸡中,通过血凝抑制试验、ELISA和淋巴细胞增殖检测ND-AI-FAdV4 cVLPs诱导的体液及细胞免疫,并进行攻毒试验评价ND-AI-FAdV4 cVLPs的攻毒保护能力。结果显示,ND-AI-FAdV4 cVLPs可诱导机体产生与NDV弱毒疫苗和AIV灭活疫苗相当的HI抗体效价及针对FAdV4 Fiber2蛋白的高水平特异性抗体,NDV、AIV和FAdV4灭活病毒的分别刺激可诱导ND-AI-FAdV4 cVLPs免疫组脾脏淋巴细胞发生活化及增殖;ND-AI-FAdV4 cVLPs免疫后可提供针对NDV强毒株NA-1株、AIV H9N2株及FAdV4强毒株攻击的有效保护,降低了病毒感染所造成的病理损伤,且缩短了体内病毒载量及体外排毒时间。本研究为ND-AI-FAdV4 cVLPs疫苗的应用奠定了基础,同时也为新城疫、禽流感和禽腺病毒病多联新型疫苗的研发提供了参考。

葛根芩连汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道屏障的保护作用机制

探讨葛根芩连汤(GQD)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)小鼠肠道黏膜屏障的保护作用及可能作用机制。自由饮用4%DSS 6d,灌胃美沙拉嗪(Mes)及不同剂量GQD治疗14 d,通过比较疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠长度及HE染色观察GQD对UC小鼠病变程度影响,免疫组化检测结肠咬合蛋白(occludin)和闭合蛋白(claudin 1)分布及水平变化,Western blot检测白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(NF-κB)和白细胞介素10(IL-10)表达评价炎症。结果表明:GQD干预后小鼠DAI评分降低,结肠长度增加,对结肠损伤有保护作用。免疫组化结果表明GQD升高了紧密连接蛋白Occludin和Claudin 1水平,Western blot结果显示GQD降低促炎因子IL-6、TNF-α和NFκB水平,升高抑炎因子IL-10水平。综上,GQD可有效保护UC的肠道黏膜屏障损伤,其可能作用机制是调节肠道紧密连接蛋白及炎症因子的水平,维持紧密连接(TJ)完整性及肠道稳态进而保护肠道屏障。

布鲁菌二联BCSP31-L7/L12-IL-2嵌合病毒样颗粒疫苗候选株的构建与鉴定

布鲁菌病的传统疫苗存在接种后干扰血清学诊断及可能出现毒力返强等缺点,严重干扰疫病监测,影响疫病净化。因此,本研究基于新城疫病毒样颗粒(ND virus like particles,ND VLPs)载体平台,利用昆虫杆状病毒表达系统和GPI锚定策略,以免疫增强因子IL-2、高保守性的保护性抗原蛋白L7/L12(来源猪种S2株)和羊种BCSP31蛋白(来源羊种M5株)为靶点,构建绿色、安全的布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒新型疫苗候选株(BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs)。PCR及免疫荧光结果表明成功构建了表达IL-2和L7/L12蛋白的重组杆状病毒,Western blot结果显示该cVLPs各组分蛋白正确表达,透射电镜观察可见表面展示纤突结构、大小约为100 nm的粒子,表明布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs构建成功。

CEF来源NDV Ex通过影响IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6与iNOS促进NDV体内增殖

将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)刺激鸡成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)产生的外泌体(NDV Ex)静脉注射7日龄SPF雏鸡,通过体内成像观察NDV Ex在体内蓄积情况与主要分布器官,qPCR检测NDV Ex作用下肺脏、脾脏、肝脏病毒载量变化与Ⅰ型干扰素的表达量变化,分离肺泡巨噬细胞并进行形态学观察及表型鉴定,通过流式细胞术检测肺泡巨噬细胞在NDV Ex作用下吞噬能力的变化,评估NDV Ex在鸡体内对NDV增殖的影响。结果表明,雏鸡静脉注入NDV Ex后荧光主要分布于肺脏;qPCR结果显示NDV Ex可以促进NDV的体内感染,并抑制肺脏、脾脏与肝脏中Ⅰ型干扰素和肺泡巨噬细胞吞噬有关细胞因子(IL-1β、IL-6和iNOS)的表达;流式细胞术结果显示NDV Ex抑制了肺泡巨噬细胞的吞噬能力。

去甲基化转移酶ALKBH5抑制新城疫病毒复制

为探究去甲基化转移酶ALKBH5对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)复制的影响,本研究通过构建慢病毒干扰细胞系和转染过表达质粒改变DF-1细胞中ALKBH5的表达量,采用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和半数组织培养感染剂量方法检测细胞感染NDV NA-1毒株后病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)基因转录、翻译和病毒粒子释放水平,并用荧光定量PCR筛选ALKBH5下游免疫因子相关靶基因。结果表明,沉默ALKBH5使NDV NP基因转录、翻译和病毒粒子释放水平明显上升;过表达ALKBH5抑制NP基因转录、翻译和病毒粒子释放;沉默ALKBH5使IL-10、IRF1等基因转录水平明显上升而抑制MDA5、IFN-β等基因的转录。结果证实,ALKBH5可能通过影响抗病毒天然免疫通路中IL-10、MDA5等相关免疫分子而负调控NDV的复制。

新城疫病毒mRNA疫苗的构建及鉴定

信使RNA(messenger RNA,mRNA)的核酸疫苗是近年来兴起的一种新型疫苗技术。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)是NDV的主要保护性抗原,可诱导机体产生中和抗体,是新城疫(Newcastle disease,ND)新型疫苗研发的重要靶点。本研究将NDV HN基因连接到含有T7启动子的载体中,并在其5′UTR和3′UTR分别引入人-β球蛋白的非编码区域以增强转录的mRNA稳定性,经质粒线性化、体外转录、cap加帽处理、mRNA纯化制备NDV HN-mRNA,将其转染至HEK-293T细胞中验证NDV HN-mRNA的表达效果,Western blot和免疫荧光试验结果表明构建mRNA候选疫苗可在HEK-293T细胞中高效表达抗原蛋白,为ND新型疫苗的研发提供新的思路。

鹅细小病毒-鹅副黏病毒二联嵌合型病毒样颗粒的构建及鉴定

基于新城疫病毒样颗粒(Newcastle disease virus-like particles,NDV VLPs)载体平台,采用胞外域替换的策略、昆虫杆状病毒表达系统、蔗糖密度梯度离心和透射电镜等方法,构建嵌合型病毒样颗粒。将鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)的VP3基因与鹅副黏病毒病(goose paramyxovirus)的HN基因相连并命名为rVP3并构建了表达rVP3蛋白的重组杆状病毒rBV-rVP3,将其与本实验室前期构建的rBV-M和rBV-HN共感染sf9细胞72 h后获得鹅细小病毒病-鹅副黏病毒病二联嵌合型病毒样颗粒(GPV-NDV cVLPs)。采用超速离心和蔗糖密度梯度离心的方法纯化GPV-NDV cVLPs,并通过透射电镜进行观察,可见与野生NDV形态相似的cVLPs;利用Western blot技术对GPV-NDV cVLPs各组分蛋白进行鉴定,结果显示蛋白表达均正确。本试验为预防鹅细小病毒病(goose parvovirus infection,GP)和鹅副黏病毒病提供一种安全的、可“一针多防”的新型疫苗候选株。

旋毛虫感染小鼠肠道菌群的变化

选取18只BALB/c小鼠进行旋毛虫灌胃,以灌胃前1d作为时间起点,于第0、1、7、14、28天分别收集小鼠粪便,同期选取12只同种小鼠作为对照。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法对小鼠粪便中双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、梭菌、拟杆菌、直肠真杆菌、柔嫩梭菌以及脱硫弧杆菌进行定量检测。结果显示,双歧杆菌数量在第7、14、28天均显著低于对照组(P<0.01),第1天无变化;乳杆菌第7、14、28天低于对照组(P<0.05),第1天无变化;肠球菌与梭菌在第7、14、28天均高于对照组(P<0.05),第1天无变化;拟杆菌、直肠真杆菌、柔内梭菌以及脱硫弧杆菌均无明显变化(P>0.05)。结果表明,旋毛虫感染可引起小鼠肠道菌群变化,从而引起小鼠肠道菌群失调。

食醋对小鼠肠道内5种细菌16SrRNA表达量变化的影响

16只C57BL/6雄性小鼠随机分为2组,食醋组作为试验组,饮用蒸馏水作为对照组。在第0、7、14、21、28天收集试验组与对照组小鼠的粪便,提取粪便细菌总DNA。采用荧光定量PCR鉴定双歧杆菌、乳酸菌、肠球菌、梭菌以及脱硫弧菌的16SrRNA表达变化。结果显示,乳酸菌16SrRNA表达量在5种待测细菌中最高。与对照组相比较,在不同时间点乳酸菌的16SrRNA表达量有变化,双歧杆菌的16SrRNA表达在试验组中有明显的升高。但双歧杆菌和乳酸菌2种益生菌的16SrRNA含量在5种检测菌中的比例维持在92.61%~99.09%。第28天时,梭菌与肠球菌在试验组中的16SrRNA表达量明显低于对照组。肠球菌、脱硫弧杆菌和梭菌3种有害菌的16SrRNA水平仅占5种细菌16SrRNA表达量的0.91%~7.32%。

新城疫、禽流感和禽腺病毒病三联嵌合型病毒样颗粒的构建及鉴定

采用新城疫病毒样颗粒载体平台和昆虫杆状病毒表达系统,将禽流感H9N2株HA、禽4型腺病毒Fiber2嵌合至新城疫病毒样颗粒载体表面进而构建“新流腺”三联嵌合型病毒样颗粒(ND-AI-FAdV4 cVLPs)。PCR及免疫荧光检测结果显示,成功构建了重组杆状病毒rBV-cFiber2;透射电镜结果显示,ND-AI-FAdV4 cVLPs直径约为100 nm、含有囊膜的空心蛋白颗粒;免疫印迹结果显示,嵌合型病毒样颗粒各组分蛋白均正确表达。本试验为新城疫、禽流感和禽腺病毒病的安全、高效病毒样颗粒新型疫苗候选株的应用奠定了基础。

吉林省四平市周边地区莱姆病流行情况调查及优势菌株外膜蛋白C的表达

为了解吉林省四平市周边地区伯氏疏螺旋体流行情况,本试验于2017年5-7月分别采集四平市周边地区蜱虫样品共25份。通过筛选扩增伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)基因片段的通用引物、优化反应条件后建立用于检测蜱体内伯氏疏螺旋体的PCR方法。从25份样品中分离到8份阳性样品(阳性率约为32%),经过测序比对发现其基因型均为Borrelia burgdorferi;并以分离到的Borrelia burgdorferi DNA为模板,PCR扩增OspC基因,构建重组质粒pET-30a-OspC,以IPTG诱导蛋白表达,为建立伯氏疏螺旋体ELISA检测方法奠定了基础。

小鼠感染旋毛虫后肠道内质网应激IRE1分子通路主要基因的表达变化

选取18只BALB/c小鼠进行旋毛虫灌胃,随机分为3组。以12只同种小鼠作为对照,也随机分为3组。于灌胃后7,14,28 d将小鼠处死并收集十二指肠与空肠组织。提取肠道组织总RNA并反转录为c DNA,运用Real-time PCR技术探讨小鼠感染旋毛虫后肠道炎症的变化和恢复过程中,内质网应激IRE1信号通路中GRP78、IRE1、XBP1分子表达的变化。结果显示,与对照组相比,小鼠感染旋毛虫后7 d,空肠中IRE、GRP78以及XBP1基因的mRNA表达均显著升高(P<0.05),并在14 d时达到峰值,尤其以GRP78的表达量升高最为显著(P<0.01),而在28 d时回落,但仍然略高于对照组。然而,感染组小鼠十二指肠的IRE1、GRP78以及XBP1基因的mRNA表达没有明显变化,无统计学意义(P>0.05)。结果表明,旋毛虫经肠道感染小鼠后,参与UPR的标志性分子GRP78、IRE1和XBP1在空肠组织的表达有明显变化,它们的上调和回落与旋毛虫感染后肠道炎症的变化和恢复过程一致,提示内质网应激反应可能参与了旋毛虫肠道感染的致病过程。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Nrf2基因及Nrf2基因过表达载体的构建

构建核转录相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)敲除HepG2细胞系及Nrf2过表达载体。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,将Nrf2-sgRNA表达载体转入HepG2细胞,嘌呤霉素筛选基因敲除细胞,构建敲除Nrf2基因HepG2细胞系。Nrf2过表达载体的构建,从HepG2细胞提取总RNA,反转录为总cDNA,并以此为模板设计Nrf2引物扩增目的基因,连接,转化,挑取阳性克隆,PCR验证,测序进一步鉴定。结果表明,获得了稳定敲除Nrf2的HepG2细胞及在HepG2细胞中稳定表达的Nrf2过表达载体,为研究Nrf2基因在动物肝损伤中的作用提供了理论依据。

免疫增强剂蛋虫草粉的喷雾干燥制备

利用喷雾干燥法制备蛋虫草粉。前期成功将北虫草菌种接种在鸡蛋卵黄囊腔内培育出蛋虫草,经消毒、粉碎、打浆、过滤后喷雾干燥,以蛋虫草粉重量为考察指标,采用单因素和正交试验法优化影响产物指标的最佳工艺参数。结果显示,进风温度150℃、进样量300 mL/h、空气流量600 L/h、干燥剂比例4%时,色泽正常,蛋虫草粉质量达最高7.59 g。结果表明,本方法简单、方便,工艺可控、稳定,为将蛋虫草开发成免疫增强剂提供试验依据。