数字PCR在肿瘤无创诊疗中的应用进展

1999年,VOGELSTEIN创造了“数字PCR”一词,文章正式报道于美国科学院院报,并表明该技术可用于发现罕见的癌症突变[1]。数字PCR(dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术,通过将一个样本分配到几十至几十万个反应单元,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,并收集荧光信号进行统计学分析。相较于传统PCR,dPCR的优势主要在于:(1)绝对定量,该技术结果判定不依赖于扩增曲线的循环阈值(Ct),不受扩增效率的影响,具有很好的准确度和重现性。(2)样品需求量低,在检测珍贵样品和样品核酸存在降解时具有明显的优势。(3)高灵敏度,dPCR本质上是将一个传统的PCR反应分成了数万个独立的PCR反应,在这些反应中可以精确地检测到很小的目的片段的差异、单拷贝甚至是低浓度混杂样品,且能避免非同源异质双链的形成。(4)高耐受性,由于目的序列被分配到多个微滴中,显著降低了体系间的影响及背景序列和抑制物对反应的干扰,扩增基质效应大大减小。因此dPCR适用于不能依靠Ct值很好分辨的应用领域,如拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。在丰度低、样本珍贵、背景复杂的肿瘤样本检测中具有良好的应用前景。

miR-27a通过抑制溶质载体家族7成员11(SLC7A11)诱导铁死亡引起大鼠脑缺血再灌注损伤

目的 探讨miR-27a在脑缺血再灌注损伤中的作用及分子机制。方法 雄性SD大鼠,随机分为对照组、假手术组、大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)模型组(依据再灌注时间又分为缺血2 h后再灌注3 h、 6 h、 12 h、 24 h组)以及阴性对照空载体组、 miR-27a激动剂(agomiR-27a)组、 miR-27a抑制剂(antagomiR-27a)组。采用Zea-Longa线栓法建立大鼠MCAO模型。实时荧光定量PCR检测脑组织中miR-27a和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)水平,Zea-Longa评分法进行神经功能评分,2, 3, 5三苯氯化四氮唑(TTC)染色检测脑梗死面积,Western blot法检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)、 SLC7A11蛋白水平,分别用谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、铁(Fe)检测试剂盒检测脑组织中GSH、 MDA、 Fe含量。通过荧光素酶报告基因验证miR-27a下游靶基因。结果 脑缺血再灌注后脑组织miR-27a水平上调,SLC7A11水平降低。抑制miR-27a表达后可显著减轻脑缺血再灌注后的神经功能障碍和脑梗死面积,抑制铁死亡。miR-27a直接靶向SLC7A11的3′-非翻译区(3′-UTR)区域,降低SLC7A11 mRNA表达。结论 脑缺血再灌注过程中上调的miR-27a可能是通过抑制靶基因SLC7A11水平,诱导铁死亡,从而引起脑组织损伤。

大鼠脑缺血再灌注早期过氧化物酶体增殖物激活受体γ活化与细胞焦亡的关系

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)活化在大鼠脑缺血再灌注损伤中与细胞焦亡的关系。方法 40只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(MCAO组)、给药组(PGZ组、PGZ+GW9662组),每组10只;采用Zea-Longa评分法进行神经功能评分,TTC染色测量脑梗死面积,运用Western blot技术分析大鼠脑组织中PPARγ,焦亡关键蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、Gasdermin D(GSDMD)及炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)的表达变化。结果与sham组比较,缺血再灌注24 h后MCAO组中PPARγ表达明显降低(P<0.05),焦亡关键蛋白caspase-1、GSDMD及炎症因子IL-1β、IL-18水平显著增高(P<0.05),神经功能评分明显增加,脑梗死面积增大(P<0.01);与MCAO组比较,PGZ组中PPARγ显著升高(P<0.05),焦亡关键蛋白caspase-1、GSDMD及炎症因子IL-1β、IL-18水平降低(P<0.05),神经功能评分显著下降,脑梗死面积减少(P<0.01);而PGZ+GW9662组中,PPARγ的作用被逆转。结论在脑缺血再灌注损伤早期PPARγ激活可通过抑制细胞焦亡产生从而减轻神经细胞损伤。

大鼠缺血性脑卒中早期miR-27a表达与铁死亡的关系

目的探讨miR-27a在缺血性脑卒中早期的表达及其与铁死亡的关系。方法88只SD大鼠采用随机数字表法进行分组。(1)正常(Control)组、假手术(Sham)组、模型组(按照缺血时间分为6、12、24和48 h组);(2)缺血48 h组(I 48 h组)、缺血48 h+Ferrostatin-1组(I 48 h+Fer-1组)、缺血48 h+DMSO组(I 48 h+DMSO组);(3)缺血48 h组(I48 h组)、缺血48 h+阴性对照组(I 48 h+NC组)、缺血48 h+miR-27a激动剂组(I 48 h+ago-miR-27a组)、缺血48 h+miR-27a抑制剂组(I 48 h+antago-miR-27a组)。分组处理结束后分离脑组织,TTC染色观察脑梗死面积,Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达情况,试剂盒检测谷胱甘肽(GSH)、组织铁、丙二醛(MDA)含量;qPCR检测miR-27a表达情况。结果(1)与Sham组相比,各缺血组miR-27a表达、铁和MDA含量升高,而GPX4和GSH表达降低(P<0.05),以缺血48 h为著。(2)与I 48 h+DMSO组相比,I 48 h+Fer-1组脑梗死面积减小,GPX4和GSH表达升高,而铁和MDA含量减少(P<0.05)。(3)与I 48 h+NC组相比,I 48 h+ago-miR-27a组中大鼠脑梗死面积及miR-27a表达增加,GPX4和GSH表达降低,铁和MDA含量增多(P<0.05);而antago-miR-27a组上述指标均出现相反变化。结论miR-27a在大鼠缺血性脑卒中早期表达升高,可通过促进铁死亡的发生而加重缺血后脑组织损伤。