红缘天牛越冬幼虫耐寒性研究

旨在探索红缘天牛越冬幼虫的耐寒性。采用热电偶法和昆虫生理生化的主要研究方法,测定越冬幼虫的过冷却点、冰点、含水率、脂肪含量、糖原含量和血淋巴中游离氨基酸种类及质量浓度,并分析上述指标变化与幼虫耐寒性的关系。结果表明:不同大小幼虫的过冷却点与冰点均无显著差异(P>0.05);幼虫经5℃1d处理后,过冷却点升高,冰点降低,均呈现显著差异(P<0.05);含水率由71.89%减至69.97%;血淋巴液中谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸占总量的百分比均有所提高;脂肪和糖原含量变化差异不显著(P>0.05)。研究结果说明:红缘天牛越冬幼虫具有较强的过冷却能力,通过调节血淋巴液中氨基酸质量浓度的变化抵御短时间低温环境变化,提高其对寒冷的适应能力。

昆虫越冬虫态及耐寒策略概述

昆虫作为生物界种物种多样性最丰富的类群之一,在长期进化过程中形成了各种提高耐寒能力和适应低温变化的策略,以度过不良环境、完成生活史和繁衍后代。为了全面深入了解昆虫的越冬耐寒性特点,本研究总结了昆虫的越冬虫态和昆虫在行为及生理生化方面的耐寒策略。重点分析归纳了昆虫如何调节体内含水量、形成体内冰核物质、改变代谢途径、积累抗冻小分子物质、产生与耐寒相关的蛋白、构成抗冻物质系统以抵御寒冷的策略等方面的研究进展,为未来昆虫耐寒性研究提供了详细全面的理论依据。

梨小食心虫发育起点温度和有效积温研究

为给梨小食心虫的预测预报及有效防治提供必要的依据,对梨小食心虫的发育起点温度和有效积温进行了研究。在17～29℃、相对湿度(70±7)%和光周期15h∶9h(光照∶黑暗)的条件下,测定了梨小食心虫各虫态的发育历期,计算了梨小食心虫卵、幼虫、蛹和全世代的发育起点温度和有效积温。结果表明,各虫态的发育历期随着温度的升高而缩短,各虫态的发育速率与温度之间具有良好的线性关系。梨小食心虫卵、幼虫、蛹及全世代的发育起点温度和有效积温分别是10.39℃和59.84℃.d、9.95℃和200.43℃.d、10.97℃和140.82℃.d、9.80℃和448.08℃.d。

昆虫耐寒性的类型、测定方法及影响因素综述

昆虫为了生存繁衍均要受外界环境的影响,遭受冬季寒冷低温的侵袭。阐明了近些年国内外关于昆虫耐寒性的类型、测定方法及影响因素等方面的研究进展,以期为耐寒性研究提供参考和借鉴。

松材线虫VAPs蛋白的原核表达、多抗制备及表达模式分析

【目的】类毒素过敏原蛋白(VAPs)是松材线虫侵染松树过程中分泌的一类蛋白。此类蛋白可通过抑制松树的防卫反应,从而利于松材线虫在松树内的定殖与扩散。本研究对4种类毒素过敏原蛋白进行原核表达、多抗制备和基因的表达模式分析,明确松材线虫Bx-VAPs蛋白的结构与功能,为阐明该类蛋白在松材线虫与寄主松树互作中的作用机理提供基础支撑。【方法】本研究利用聚合酶链式反应(PCR)扩增松材线虫4个Bx-VAPs基因,通过实时荧光定量(RT-qPCR)方法检测不同龄期松材线虫4个Bx-VAPs基因的表达量。同时,将扩增的4个基因全长产物分别转化至pET32b原核表达载体,构建重组质粒pET-32b-VAPs,经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3进行诱导表达。利用纯化的Bx-VAPs蛋白分别免疫Balb/c鼠,4次免疫后获得多克隆抗体;采用间接酶联免疫吸附法ELISA测定抗体血清效价;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行蛋白鉴定。最后,应用生物信息学方法分析这四个蛋白的理化性质、二级结构和表面特性,预测B细胞抗原表位。【结果】松材线虫4个Bx-VAPs基因在不同龄期的表达量存在显著差异,其中Bx-VAP1和Bx-VAP2基因在成虫期表达量较高,Bx-VAP3和Bx-VAP4基因在繁殖型L3时期表达量较高。构建获得的重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白分子量介于21~31 kDa之间,纯化后的多克隆抗体anti-VAP1、anti-VAP2和anti-VAP3均对松材线虫蛋白液具有较高的特异性,但anti-VAP4抗体未能与松材线虫蛋白液结合反应。4个Bx-VAP蛋白的二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,存在信号肽,具有SCP结构域,无跨膜结构域,Bx-VAP1潜在的优势B细胞抗原表位较多。【结论】重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白大小与预测的蛋白大小一致,均为包涵体表达,制备的多克隆抗体anti-VAP1、anti-VAP2和anti-VAP3效价高,特异性良好,Bx-VAP1具有潜在的B细胞抗原表位优势,为进一步研究松材线虫VAPs蛋白的功能及其相关致病机制研究提供了实验材料和基础。

不同寄主对小线角木蠹蛾幼虫消化解毒酶的影响

小线角木蠹蛾Streltzoviella insularis是一种重要的林木蛀干害虫,在我国北方地区广泛分布,其寄主范围广,尤其对城市园林树种威胁严重。本研究测定了小线角木蠹蛾幼虫分别取食3种喜食寄主(洋白蜡、银杏和国槐)和4种普通寄主(旱柳、栾树、香椿、毛桃)后的解毒酶(细胞色素P450酶、谷胱甘肽S转移酶和羧酸酯酶)和消化酶(内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶)的活性。结果表明,不同寄主对小线角木蠹蛾幼虫的消化酶和解毒酶都存在显著影响,其中取食普通寄主的幼虫3种解毒酶的平均活性(P450、GST和CarE酶活性分别为21.12、4876.86、0.035μmoL/min/mg protein)均高于取食喜食寄主的幼虫(P450、GST和CarE酶活性分别为15.87、3760.55、0.027μmoL/min/mg protein),且普通寄主的平均次生代谢物质含量更高(普通寄主总酚、类黄酮和单宁含量分别为173.10、110.07、88.77 mg/g,喜食寄主为105.22、14.05、55.74 mg/g);而取食普通寄主与喜食寄主的幼虫EG和CBH酶活性之间没有显著差异,仅取食普通寄主的幼虫β-葡糖苷酶活性和木聚糖酶活性略高于取食喜食寄主的幼虫,幼虫的消化酶活性(纤维素酶和半纤维素酶)和寄主营养物质(纤维素和半纤维素)并未在普通寄主和喜食寄主中表现出明显趋势。因此本研究认为小线角木蠹蛾的寄主适应性与寄主次生代谢物质(总酚、类黄酮和单宁)含量的关联性更强,而与营养物质(纤维素和半纤维素)含量的相关性较弱。

杨树HSP90基因的克隆及生物信息学分析

【目的】为了揭示热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因在杨树抗溃疡病中的功能,克隆获得毛白杨HSP90基因的全长序列,以期明确HSP90基因的表达与溃疡病菌侵染间的关系。【方法】采用RT-PCR技术和Gateway克隆的方法,获得了毛白杨的HSP90基因序列,并利用相关软件对该基因编码的蛋白的理化性质、疏水性、结构域、功能及亚细胞定位等进行了生物信息学分析。【结果】毛白杨的HSP90基因序列(NCBI登录号:AGU99972.1)全长为2 100 bp,其中A+T占52.90%,C+G占47.10%,共编码699个氨基酸。毛白杨HSP90基因的生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白相对分子质量为80.08 kDa,理论等电点为4.96。毛白杨HSP90蛋白主要位于细胞核和细胞质膜中,且在N端含有1个基因保守结构域HATPase_c,可与ATP结合,具有内源ATPase活性,属于HSP90家族,为亲水性蛋白,可能具有离子通道的功能。同时,对毛白杨的HSP90基因进行系统进化分析,发现毛白杨的HSP90基因与毛果杨(gi 539331543)、大豆(gi 358248990和gi 356552478)的亲缘关系较近,而与毛果杨(gi 224124864)的亲缘关系相对较远,说明同一物种的HSP90进化可能有所不同。【结论】首次从毛白杨中成功克隆得到与抗溃疡病相关的HSP90基因,并对其序列和生物学信息进行了分析,为下一步研究HSP90基因在杨树抗溃疡病中的功能奠定基础,也为进一步研究HSP90基因在杨树抗逆胁迫中的生理功能提供了理论支持。

冷驯化对油松毛虫越冬幼虫过冷却点及主要耐寒物质的影响

【目的】冷驯化可增强昆虫的耐寒性,本文研究旨在明确不同冷驯化条件下油松毛虫Dendrolimus tabulaeformis Tsai et Liu越冬幼虫的过冷却点和主要耐寒物质的变化规律。【方法】利用热电偶方法测定越冬幼虫的过冷却点,分别采用差量法、氯仿甲醇法、苯酚硫酸法及毛细管气相测谱法测定其含水率、脂肪、糖原和小分子糖醇的含量。【结果】冷驯化会导致幼虫含水率显著降低;过冷却点和脂肪含量在低于环境气温5℃冷驯化后显著降低,当驯化温度低于环境气温10℃及以上则升高;糖原含量在9月份显著增加,越冬中期(1、3月份)含量略有降低但不显著;小分子糖醇含量的变化均不显著;海藻糖含量略降低;甘油、葡萄糖和半乳糖含量在低于环境气温5℃冷驯化后略降低,低于环境气温10℃冷驯化则升高。【结论】冷驯化使幼虫虫体含水率和脂肪含量降低,糖原含量提高,从而导致其过冷却点降低,耐寒能力提高;冷驯化的温度和时间均会影响其过冷却能力,在最适合的温度和时长可以最大程度提高其耐寒能力。研究结果为揭示油松毛幼虫的耐寒机制及潜在分布区预测提供了科学依据。

松材线虫性别决定基因Bx⁃sex⁃1表达特征和生物学功能分析

【目的】揭示松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)性别决定基因Bx⁃sex⁃1的表达特征和生物学功能。【方法】通过Mega 6中的Jones⁃Taylor⁃Thornton(JTT)模型,采用邻接法(neighbor joining,NJ)对Bx⁃sex⁃1和其他线虫的氨基酸序列进行系统发育构建。采用同步培养的方法分别收集不同龄期的松材线虫并提取总RNA,反转录获得cDNA并采用实时荧光定量PCR(qRT⁃PCR)的方法,研究Bx⁃sex⁃1在松材线虫不同发育阶段的相对表达量。同时采用qRT⁃PCR并通过绝对定量法分析Bx⁃sex⁃1基因在雌虫和雄虫基因组的拷贝数。采用dsRNA浸泡法对目的基因进行干扰,观察松材线虫后代卵的孵化率和雌雄比的变化。【结果】系统进化树显示松材线虫Bx⁃sex⁃1和其他两个植物寄生线虫成为一支,与自由生线虫和寄生动物线虫分别进化为不同的分支。松材线虫Bx⁃sex⁃1在不同发育阶段相对表达量有差异,在卵期相对表达量最高,而在2龄幼虫时期最低,从2龄幼虫时期到成虫时期相对表达量逐渐升高。qRT⁃PCR结果显示Bx⁃sex⁃1基因在雌虫和雄虫基因组中均为单拷贝。Bx⁃sex⁃1被干扰后,卵的孵化率下降,雌雄比降低。【结论】松材线虫Bx⁃sex⁃1基因在卵的发育过程和性别决定中可能具有重要作用。

小线角木蠹蛾幼虫适应不同寄主的转录组学分析

【目的】通过比较小线角木蠹蛾Streltzoviella insularis Staudinger幼虫取食不同寄主后的肠道转录组,旨在挖掘幼虫对寄主适应的相关基因,为探究小线角木蠹蛾幼虫对寄主的适应机制提供分子生物学数据。【方法】采用Illumina二代测序技术,测定小线角木蠹蛾幼虫取食3种不同寄主树种(洋白蜡、银杏和国槐)15 d后的肠道转录组,使用BLAST软件对unigene序列进行GO和KEGG富集,通过比较分析筛选出幼虫对寄主适应的相关基因。【结果】取食国槐与取食洋白蜡的小线角木蠹蛾幼虫的差异表达基因数量有916个,取食银杏与取食洋白蜡的小线角木蠹蛾幼虫的差异表达基因数量为1163个,取食银杏与国槐的小线角木蠹蛾幼虫的差异表达基因数量为1621个;其中,上调表达的差异基因与解毒代谢、水解酶和转运蛋白等密切相关;取食不同寄主的幼虫肠道差异基因中,解毒酶(17个)和消化酶(20个)的差异基因数量都明显多于保护酶(5个)。本研究筛选出2个解毒酶基因、3个消化酶基因和1个保护酶基因,可作为小线角木蠹蛾幼虫对寄主适应机制的重点研究对象。【结论】本研究初步揭示了小线角木蠹蛾幼虫响应不同寄主的差异表达基因,为进一步探究小线角木蠹蛾对寄主的适应机制提供了基础依据。