IL-33在人非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织和癌旁组织中IL-33的表达情况。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测61例NSCLC患者的肿瘤组织和癌旁组织中IL-33 mRNA的表达水平,再用免疫组织化学染色进一步检测12例不同组织学类型的NSCLC石蜡标本中IL-33的蛋白定位与表达,分析其与肺癌患者临床病理参数、总生存(OS)之间的关系。结果 IL-33 mRNA在肺癌组织中的表达量明显低于癌旁组织,免疫组织化学染色结果表明IL-33蛋白定位于细胞核,并在肺癌组织中低表达。此外,IL-33在肺癌组织中的表达与肺癌病理类型有关,与患者临床病理特征年龄、性别、吸烟史、病理分级和临床分期等均无关;Kaplan-Meier生存曲线分析表明,IL-33 mRNA表达水平与术后生存时间显著正相关。结论 IL-33可能在肺癌的发生发展以及靶向治疗中发挥重要作用。

清醒大鼠高胰岛素-正血糖钳夹技术的建立和应用

目的建立大鼠高胰岛素-正血糖钳夹模型,并探讨短期输注脂肪乳对清醒状态下大鼠葡萄糖输注率(GIR)的影响。方法 SPF级雄性SD大鼠10只,随机数字表法分为2组,每组5只。采用颈动、静脉插管技术,分别经颈静脉给予SD大鼠输注20%脂肪乳(脂肪乳组)和5%葡萄糖6 h(对照组),行高胰岛素-正血糖钳夹实验测定血浆游离脂肪酸(FFA)和GIR。结果与葡萄糖输注的对照组比较,脂肪乳组大鼠输注20%脂肪乳6 h后,血浆FFA水平升高到对照组的17.6倍(P<0.01),GIR下降了27%(P<0.001),胰岛素抵抗非常明显。结论成功建立大鼠高胰岛素-正血糖钳夹技术,给大鼠输注脂肪乳可导致明显的胰岛素抵抗。

双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α mRNA表达水平

目的:建立单管检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法。方法:脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA,经反转录合成c DNA,应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针,经PCR扩增后,在FAM通道和CY5通道分别读取Ct值,同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果:双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α的灵敏度达4×101拷贝/μL,检测线性范围可达6个数量级,批内和批间重复性好。结论:新方法消除了目的基因与内参的加样误差,节约成本,快速准确,适用于TNF-αmRNA的定量检测。

颈动脉粥样硬化患者MT2A-838G/C和MCP-1-2518G/A基因多态性分析

目的:探讨苏南地区汉族人群MT2A-838G/C和MCP-1-2518G/A基因多态性与颈动脉粥样硬化的相关性。方法:采用碱基淬灭探针技术检测103例有颈动脉斑块患者和46例正常对照的MT2A基因-838位点和MCP-1基因-2518位点基因型分布及基因频率,并评价基因多态性与颈动脉粥样硬化易感性之间的相关性。结果:在对照组和病例组中,MT2A 3种基因型GG、GC、CC的频率分别为52.17%、36.96%、10.87%和50.49%、36.89%、12.62%(P>0.05),等位基因G、C的频率分别为70.65%、29.35%和68.93%、31.07%(P>0.05);MCP-1 3种基因型AA、AG、GC在对照组和病例组中的频率分别为15.22%、52.17%、32.61%和20.39%、44.66%、34.95%(P>0.05),等位基因A、G的频率分别为41.30%、58.70%和42.72%、57.28%(P>0.05)。结论:MT2A-838G/C及MCP-1-2518G/A基因多态性可能不是苏南汉族人群发生颈动脉粥样硬化的独立危险因素。

双重荧光实时PCR法鉴定SRBⅠ基因敲除小鼠

目的建立一种双重荧光实时PCR鉴定B族Ⅰ型清道夫受体(SRBⅠ)基因敲除小鼠的方法。方法提取小鼠尾尖DNA,应用自行设计的鉴定野生型和敲除型SRBⅠ基因的引物和探针,经PCR扩增后,在FAM通道及CY5通道判断小鼠基因型。同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果仅在FAM通道出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因野生型小鼠,仅在CY5通道出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因敲除型小鼠,在两个通道都出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因杂合型小鼠。结果与DNA测序法吻合,检测野生型和突变型的灵敏度均达4×101拷贝/μL。结论新方法简单、快速、准确,适用于分型SRBⅠ基因敲除小鼠。

应用碱基猝灭探针法检测α-1抗胰蛋白酶基因342Glu→Lys突变

目的利用碱基猝灭探针技术建立检测编码α-1抗胰蛋白酶基因342Glu→Lys突变位点的新型诊断方法。方法探针3'端标记6-羧基荧光素,同时构建2个载体作为阳性对照模板,分别代表两种可能的纯合子基因型,即野生型和PiZZ纯合突变型。用熔解曲线对两种不同基因型结果进行分析判断,并验证检测方法的准确性和灵敏度。结果熔解曲线分析显示,338例患者标本均在50℃左右出现熔解谷,即所有标本均为野生型;Kappa检验结果显示,该法的检测结果与DNA测序法完全一致(k=1,P=0.000)。灵敏度分析结果显示,模板DNA量在103拷贝时可以看到明显的熔解谷。结论构建的方法准确、简单、经济,适合大规模对α-1抗胰蛋白酶基因342Glu→Lys突变位点的分型诊断。

黄葵胶囊对糖尿病肾病肠道菌群的影响及机制研究

目的探讨黄葵胶囊对糖尿病肾病患者肠道菌群的影响及作用机制。方法选取2017年5月—2019年5月医院收治的糖尿病肾病患者,共96例,作为本次的研究对象,随机分为对照组和试验组,各48例。对照组行使控制血压、血脂和血糖等常规治疗。试验组患者同样实施糖尿病肾病常规治疗,并且在此基础上联合黄葵胶囊治疗,患者在治疗前和治疗2个月后分别抽取空腹外周静脉血,检测空腹血糖(FBG),尿素氮(BUN)、24 h尿白蛋白清除率(24 h UAER),血肌酐(SCr)。采集并化验各组患者粪便,稀释样本涂片、革兰染色鉴定肠道菌群中革兰氏阳/阴性杆菌和革兰氏阳/阴性球菌的分布状况。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增重要菌群拟杆菌、双歧杆菌、柔嫩梭菌和乳杆菌的特异性片段,计算含量,分析患者在联合黄葵胶囊治疗后上述菌群的变化差异。结果治疗两个月后,与对照组相比试验组患者的FPG、BUN、24 h UAER、SCr、β2-MG等各项生化指标均显著性降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,黄葵胶囊治疗2个月后,试验组患者肠道内的革兰氏阳性和阴性杆菌均升高。与对照组相比,肠道内的4种重要的菌群拟杆菌、双歧杆菌、柔嫩梭菌和乳杆菌均发生显著改变,联合黄葵胶囊治疗的试验组患者中拟杆菌、双歧杆菌的含量较低,而柔嫩梭菌和乳杆菌相对升高。结论黄葵胶囊有助改善和调节糖尿病肾病患者血糖水平,影响肠道菌群的分布和亚群,为进一步研究黄葵通过肠道菌群评估糖尿病肾病患者发生、发展和治疗提供了一定的数据基础。

鉴定清道夫受体BI基因敲除突变小鼠的新方法

目的建立一种清道夫受体BI(SR-BI)基因敲除突变小鼠基因型的鉴定方法。方法参照碱基淬灭探针技术原理,设计鉴定野生型和突变型SR-BI基因的引物探针。反应体系经PCR扩增后,利用融解曲线功能判断小鼠基因型。结果新方法可在1h内完成基因型分析。野生型和突变型纯合子小鼠分别在(53.25±0.81)℃及(62.25±0.31)℃处出现单个融解谷;而杂合子小鼠在两处均出现融解谷。结论新方法简单、快速、准确,适用于鉴别SR-BI基因敲除突变小鼠的基因型。

过表达人载脂蛋白M基因对GK大鼠胰岛素敏感性的影响

目的 探讨过表达人载脂蛋白M（ApoM）基因是否改善Goto-Kakizaki （GK）大鼠胰岛素敏感性.方法 以慢病毒（LV）为载体,构建含人ApoM基因的重组慢病毒[LV4 （GFP）-ApoM].转染293T细胞24 h后,采用聚合酶链反应（PCR）芯片分析2型糖尿病相关基因;将10只GK大鼠随机分为ApoM阴性慢病毒组和ApoM阳性慢病毒组,每组5只.尾静脉注射5＆#215;108 TU慢病毒,用实时定量PCR（Real-time PCR）法检测ApoM mRNA水平,胰岛素耐量实验评价GK大鼠胰岛素敏感性.结果 （1）相较于ApoM阴性慢病毒组,293T细胞ApoM阳性慢病毒组ApoM mRNA水平增加79.43倍（P＜0.01）;同时,与胰岛素抵抗相关的基因丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）下调了2.11倍（P＜0.05）,胰岛素样生长因子2（IGF2）下调1.23倍（P＜0.05）.（2）ApoM阳性慢病毒组GK大鼠肺组织中人ApoM mRNA表达较为明显;第14天GK大鼠空腹血糖水平和对照组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）,但胰岛素耐量实验结果显示ApoM阳性慢病毒组GK大鼠血糖浓度下降50％的时间（60 min）明显早于ApoM阴性对照组（90 min）.结论 过表达ApoM基因有可能增强2型糖尿病个体的胰岛素敏感性.

游离脂肪酸下调载脂蛋白M的表达及其机制

游离脂肪酸（FFA）是构成人体的重要成分,参与血脂代谢.研究表明,FFA水平升高可导致外周胰岛素抵抗,而胰岛素抵抗的个体载脂蛋白M（ApoM）水平下降[1].本研究旨在观察FFA水平升高是否会直接下调ApoM并探讨其机制.一、材料和方法大鼠血浆FFA浓度检测、肝脏组织中mRNA的提取、逆转录、实时定量聚合酶链反应和PCR芯片（Qiagen公司）反应严格参照试剂盒说明书操作.大鼠ApoM和内参照基因β-肌动蛋白的引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成.统计学分析参照文献[2].

棕榈酸下调载脂蛋白M表达及其机制研究

目的明确棕榈酸对载脂蛋白M（apolipoproteinM，ApoM）表达的影响及其机制。方法用不同浓度棕榈酸处理人肝癌细胞株（HepG2细胞），采用实时定量PCR及PCR芯片分析棕榈酸对ApoM表达的影响和可能的机制。分别用棕榈酸（1mmol／L）和（或）PI-3K抑制剂LY294002（LY，10μmol／L）、蛋白激酶C抑制剂GFl09203X（GFX，2μmol／L）以及PPARβ／δ的拮抗剂GSK3787（10μmoL／L）处理HepG2细胞，实时定量PCR检测ApoM相关基因表达水平。结果0、0．25、0．5及1mmol／L棕榈酸分别作用于HepG2细胞后，ApoMmRNA表达水平显著下降，且呈剂量依赖性（P〈0．01）。人胰岛素信号通路PCR芯片检测结果显示，棕榈酸通过其中的6条信号途径影响HepG2细胞的增殖。LY对HepG2细胞ApoMmRNA表达的影响差异无统计学意义（P〉0．05），且LY不能逆转棕榈酸下调HepG2细胞ApoMmRNA的表达。GFX明显降低ApoMmRNA的表达水平（P〈0．05），但GFX不影响棕榈酸降低ApoMmRNA的效应。1mmol／L棕榈酸显著升高HepG2细胞PPARp／8mRNA水平（P〈O．001）；PPARB／8拮抗剂GSK3787对ApoMmRNA表达的影响无统计学意义（P〉0．05）；但其能够显著抑制棕榈酸降低HepG2细胞ApoM mRNA的效应（P〈0．05）。结论棕榈酸通过PPARβ／δ途径下调HepG2细胞ApoM基因表达，详细机制还需进一步研究。

高糖输注及罗格列酮干预对大鼠载脂蛋白M表达的影响

目的观察高浓度葡萄糖输注对大鼠载脂蛋白M（apoM）mRNA的表达的影响及罗格列酮干预的作用，并探讨相关机制。方法雄性SD大鼠随机分为5％葡萄糖组（对照组）、25％葡萄糖组（H组）、罗格列酮＋5％葡萄糖组（RN组）、罗格列酮＋25％葡萄糖组（RH组）4组。分两批独立的实验完成，一批应用高胰岛素．正常血糖钳夹（HEC）实验评价葡萄糖输注率（GIR），一批直接取肝脏提取总RNA，检测apoMmRNA表达水平及肝X受体途径（LXR）基因和PPAR-β/δ基因表达情况。结果葡萄糖和罗格列酮对GIR均有影响（均为P〈0．01），并且两者的交互作用差异有统计学意义（P〈0．01）。25％葡萄糖下调大鼠肝脏apoMmRNA表达（P〈0．05），而罗格列酮明显增高大鼠肝脏apoMmRNA的表达（P〈0．0001），但两者的交互作用差异无统计学意义（P〉0．05）。25％葡萄糖显著抑制大鼠肝脏LXR-β（P〈0．01）、SHP1（P〈0．01）、LRH1（P〈0．01）、ABCA1（P〈0．01）、PPAR．13／8（P〈0．01）基因的表达；而罗格列酮仅降低SHP1（P〈0．01）及ABCA1（P〈O．05）基因的表达。罗格列酮显著抑制正常大鼠肝脏ABCA1mRNA的表达（P〈0．05），但在高血糖状态下，罗格列酮则明显升高大鼠肝脏ABCA1mRNA水平（P〈0．01）。双因素方差分析表明罗格列酮和25％葡萄糖对大鼠肝脏ABCA1mRNA影响的交互作用差异有统计学意义（P〈0．01）。结论高浓度葡萄糖和罗格列酮对apoM的调节作用是相对独立的，高浓度葡萄糖有可能主要通过LRH1和（或）ABCA1途径下调apoM基因的表达。

载脂蛋白M基因敲除小鼠模型的构建和鉴定

人载脂蛋白M（ApoM）由Xu等[1]于1999年发现,主要存在于具有抗动脉粥样硬化作用的高密度脂蛋白（HDL）中[2].研究显示,瘦素、胰岛素、高血糖以及多种细胞因子可调节ApoM的表达[3-4],也可能与肥胖、糖尿病、肝癌、结肠癌的发生发展相关[5-6],但其作用机制尚不明确,其功能有待进一步研究.本研究旨在构建ApoM基因敲除小鼠模型并建立分型ApoM基因敲除小鼠的方法.

雌激素通过雌激素受体上调载脂蛋白M表达

目的研究雌激素对载脂蛋白M的影响。方法采用RT—PCR法检测不同浓度、不同作用时间雌激素处理HepG2细胞以及雌激素和雌激素受体拮抗剂共同处理后，HepG2细胞载脂蛋白MmRNA的表达；将sD雌性大鼠分为5组：去卵巢组（OVX）；假手术组（Sham）；去卵巢＋苯甲酸雌二醇（EB）组（OVX＋EB）；正常大鼠组（对照组）；正常大鼠＋EB组（EB组），术后给予不同剂量的EB。常规生化检测血液标本中血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL），RT—PCR和Western印迹检测鼠apoM表达。结果雌激素上调HepG2细胞载脂蛋白M的表达，这种效应呈剂量和时间依赖性，可以被ER拮抗剂抑制。术后第1个月，OVX＋EB组和EB组大鼠apoMmRNA水平以及血清apoM、HDL、总胆固醇、甘油三酯和LDL水平分别较OVX组和对照组大鼠有显著性升高（P〈0．05）。结论雌激素通过ER途径上调载脂蛋白M的表达。