Fsp27基因沉默载体的构建及其对细胞脂解的影响研究

构建脂肪特异性蛋白27(Fat-specific protein of 27,Fsp27)基因沉默载体,研究沉默Fsp27基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响,并对其作用机制进行探究。采用RNAi技术,构建Fsp27基因真核干扰载体,下调Fsp27基因的表达。“鸡尾酒”法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。脂质体转染脂肪细胞,油红O染色脂滴,酶法测定细胞中甘油及甘油三酯的含量。Western blot法检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ的蛋白表达。Western blot结果显示:阳性sh-Fsp27干扰载体均能有效下调Fsp27的表达,且伴随细胞内ATGL和PPARγ的表达量升高(P<0.05),其中sh-Fsp27-2的沉默效果最好;酶学方法检测结果显示:阳性sh-Fsp27干扰组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P<0.05);油红O染色结果发现:空白对照组与阴性对照组均有大脂滴堆积,阳性sh-Fsp27组小脂滴分布广泛,未见明显的大脂滴。sh-Fsp27-2组基因沉默载体的沉默效果最好,Fsp27基因沉默可以加快3T3-L1细胞的脂解速率,其主要是通过抑制脂滴融合和增强ATGL酶的水解来完成对脂解的调控。

围脂滴蛋白基因CRISPR/Cas9载体的活性分析

设计并验证能够靶向切割PLIN1基因的sgRNA,为建立高效的PLIN1基因敲除动物模型奠定基础。利用预测软件设计3条评分较好的sgRNA。添加T7启动子后体外转录相应的sgRNA,构建酶切体系并验证其体外切割活性。构建相应的基因敲除质粒载体,通过电转染将质粒转到3T3-L1前脂肪细胞内并进行诱导分化。RT-PCR法检测细胞中PLIN1 mRNA的表达,Western blot法检测细胞中PLIN1蛋白的表达。成功在体外转录3条PLIN1的sgRNA并构建酶切体系,测得sgRNA-PLIN1-1的切割效率为61.8%±9.0%,sgRNA-PLIN1-2的切割效率为64.1%±9.6%,sgRNA-PLIN1-3的切割效率为34.1%±7.2%,sgRNA-PLIN1-3组的切割效率明显低于sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组(P<0.05)。成功构建3条sgRNA的质粒载体并电转染进入3T3-L1前脂肪细胞内,转染效率约为30%。诱导分化的第4天,各阳性干扰组PLIN1 mRNA的表达量显著降低(P<0.01);与sgR NA-PLIN1-3组相比,sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组PLIN1 mRNA的表达量有显著性差异;各阳性干扰组PLIN1蛋白的表达量显著降低(P<0.01),阳性干扰组相互之间PLIN1蛋白的表达量无显著性差异。3条sgRNA皆可以靶向切割PLIN1基因的2号外显子,其中gRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组的切割活性略高于sgRNA-PLIN1-3组。体外活性切割实验可以很好的预测细胞内切割效果,是筛选高活性sgRNA的有效手段。

基于CRISPR/Cas9技术构建Plin1基因敲除小鼠模型及表型分析

利用CRISPR/Cas9技术构建纯合围脂滴蛋白(Plin1)基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。针对Plin1基因2号外显子前后序列设计sgRNA并构建表达载体,体外转录获得sgRNA后与Cas9蛋白混合,显微注射至小鼠受精卵中并进行胚胎移植。出生小鼠经测序及PCR基因型鉴定获得F_(0)代阳性小鼠;令F_(0)代小鼠与野生型小鼠杂交,获得F_(1)代杂合子小鼠;通过F_(1)代杂合小鼠近交,获得F_(2)代纯合子小鼠模型。常规饲喂同窝别Plin1基因敲除纯合小鼠、杂合小鼠和野生型小鼠,并测量小鼠体重、身长等体格参数;定量实时聚合酶链反应(Q-RT-PCR)和蛋白质印迹(WB)分别检测每个组织中Plin1基因在mRNA和蛋白质水平的表达。敲除了小鼠Plin1基因741 bp的片段(包含了2号外显子在内);Plin1基因敲除小鼠PLIN1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);常规喂养4周后,相比于野生型及杂合型小鼠,纯合型Plin1基因敲除小鼠体重显著降低(P<0.05)。成功构建了Plin1基因敲除小鼠模型;初步表型分析发现,Plin1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比较为瘦弱。

Plin1基因敲除对肥胖小鼠脂质代谢的影响及机制

目的研究Plin1基因敲除对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂质代谢的影响并探究其可能的作用机制。方法普通C57BL/6J小鼠12只,随机分为普通组和高脂组,每组6只,Plin1基因敲除小鼠12只,随机分为敲除普通组和敲除高脂组,每组6只。喂养12 w后称量各组小鼠体重,取出白色和棕色脂肪组织称重并用HE染色观察不同脂肪组织的形态变化;试剂盒检测小鼠血清脂质相关指标;WB法检测脂质代谢相关蛋白的表达。结果与普通组相比,高脂组小鼠体重和脂肪组织重量显著增加(P<0.05),TG、TC、LDL-C、Glycerin和FFA水平均显著升高(P<0.05),平均脂肪细胞面积变大(P<0.05),脂肪组织中SREBP1蛋白表达明显增加(P<0.05),p-HSL和ATGL的蛋白表达量显著下降(P<0.05);与高脂组相比,敲除普通组和敲除高脂组小鼠体重显著减轻,其脂肪重量和系数也明显下降(P<0.05),血清中TG、TC水平降低,HDL-C水平升高(P<0.05),WAT细胞体积缩小,BAT细胞空泡增多,脂肪组织中SREBP1蛋白表达下降(P<0.05),HSL、p-HSL和ATGL蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论Plin1基因敲除能够通过调控脂质代谢相关蛋白表达进而抑制高脂饮食诱导的小鼠肥胖。

CRISPR/Cas9敲除PLIN1基因增强3T3-L1脂肪细胞的脂解作用

应用CRISPR/Cas9技术敲除3T3-L1前脂肪细胞plin1,观察PLIN1缺失对脂肪细胞中脂肪水解的影响并探究可能机制。常规培养3T3-L1前脂肪细胞,电穿孔法转染plin1敲除载体,嘌呤霉素培养基挑选plin1敲除细胞,观察转染及筛选后的细胞存活率。"鸡尾酒"法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,酶法测定甘油和TG含量,油红O染色观察脂滴形态及数目的变化。Western blotting检测PLIN1、PPARγ、Fsp27和脂肪酶的蛋白表达;RT-PCR检测PLIN1和脂肪酶的mRNA表达。对照组细胞诱导分化后,微小脂滴数目较少,单房脂滴数目较多并围绕细胞核呈环型排列。相较于对照组,敲除组细胞诱导分化后微小脂滴数目增加,单房脂滴体积缩小,数目减少;细胞中PLIN1mRNA及蛋白表达被显著抑制(P<0.05);甘油水平显著上升(0.0984±0.0076),TG含量显著下降(0.0310±0.0053);HSL和ATGL两种脂肪酶的mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05);PPARγ和Fsp27的表达未有明显变化。上述结果表明plin1敲除后通过暴露脂滴中脂质以及上调脂肪酶等效应增强了3T3-L1脂肪细胞的脂解作用。

橙皮苷对肥胖小鼠脂肪组织脂质代谢的作用及机制

目的研究橙皮苷对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂肪组织脂质代谢的作用并探究其可能的分子机制。方法将40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常(N)、高脂(HF)、低剂量橙皮苷干预[HP-L,200mg/(kg·d)]及高剂量橙皮苷干预[HP-H,400mg/(kg·d)]共4组,每组10只。灌胃干预12w后,比较各组小鼠体重变化,称量脂肪组织并计算肾周和附睾脂肪系数;酶法检测血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量;HE染色观察各组小鼠脂肪组织形态变化;Western blot检测附睾脂肪中PLIN1、HSL、ATGL和SREBF1蛋白的表达水平。结果与N组相比,HF组小鼠体重显著增加(P<0.05),血清TC、TG和LDL-C水平均明显上升(P<0.05),HDL-C水平下降(P<0.05),脂肪细胞体积变大,附睾脂肪中PLIN1、HSL和ATGL蛋白表达显著降低(P<0.05),SREBF1表达升高(P<0.05);与HFD组相比,HP-L组和HP-H组小鼠体重减轻(P>0.05,P<0.05),肾周、附睾脂肪重量和系数降低(P<0.05),且在HP-H组更加明显,血清TC、TG和LDL-C水平均显著下降(P<0.05),HP-L组HDL-C水平上升(P<0.05),HP-L组和HP-H组脂肪细胞体积明显缩小(P<0.05),附睾脂肪中PLIN1、HSL和ATGL蛋白表达显著升高(P<0.05),SREBF1表达降低(P<0.05)。结论橙皮苷能够通过调节脂质代谢相关蛋白表达,促进脂肪组织脂质分解,抑制脂质合成,从而改善肥胖小鼠脂质代谢异常,达到降脂减肥效果。

Plin1基因敲除对肥胖小鼠脂肪组织炎症反应的影响及机制研究

目的探究Plin1基因敲除对肥胖小鼠脂肪组织炎症水平的作用及其可能分子机制。方法将雄性野生型C57BL/6J小鼠和Plin1基因敲除小鼠随机分为普通饲料组和高脂饲料组4组(n=6),喂养12 w后,隔夜禁食自由饮水12h,眼眶采取所有新鲜血液及组织样本,并颈椎脱臼处死,取各组小鼠血清及部分附睾脂肪组织,酶法测定小鼠血清中游离脂肪酸(nonesterified fatty acid,NEFAs)的水平;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试验测定小鼠血清和脂肪组织中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)及单核细胞趋化因子1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的水平;免疫组织化学染色法观测F4/80的表达程度;免疫荧光染色法和Western blot法观察核因子κB(Nuclear Factor kappa-B,NF-κB)亚基P65的转位及表达水平和NF-κB亚基P65表达及磷酸化差异。结果与CON-C组相比,CON-H组小鼠血清中NEFAs,TNF-α和IL-6水平均显著升高,MCP-1水平变化不显著,脂肪组织TNF-α、IL-6及MCP-1水平显著升高,脂肪组织F4/80表达升高,NF-κB P65荧光强度及核转位增多,p-P65表达升高(P<0.05);KO-C组小鼠血清和脂肪组织具有类似改变。与CON-H组相比,KO-H组小鼠血清中IL-6和MCP-1无显著改变,NEFAs和TNF-α水平显著升高,脂肪组织中TNF-α、IL-6及MCP-1水平显著升高,脂肪组织F4/80表达,P65荧光强度及核转位,p-P65表达均显著升高(P<0.05)。结论Plin1基因敲除促进肥胖小鼠脂肪组织的炎症反应,其机制可能为Plin1失活后小鼠脂肪组织过度脂解,促进了M1型巨噬细胞的极化与浸润,激活NF-κB通路导致促炎因子的释放。