葡萄糖调节蛋白75对棕榈酸诱导的MIN6细胞脂毒性的影响及机制研究

目的探讨葡萄糖调节蛋白75(Mortalin)对棕榈酸诱导的MIN6细胞脂毒性的影响和机制。方法无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/6J小鼠,20只,6~8周,20~24 g。采用随机数字表法将小鼠分为标准饮食组(SD)和高脂饮食组(HFD),每组10只。使用免疫荧光染色法、免疫组织化学法检测小鼠胰腺组织中Mortalin的表达情况。通过慢病毒转染构建Mortalin敲低(Sh-Mortalin)的MIN6稳转细胞株,根据使用牛血清白蛋白(BSA)还是棕榈酸(PA)处理敲低和空载细胞将其分为Sh-Mortalin组、Mortalin敲低空载组(ShNC-Mortalin组)、Sh-Mortalin+PA组、ShNC-Mortalin+PA组,按应用细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂U0126还是二甲基亚砜(DMSO)将细胞分为Sh-Mortalin+DMSO组、Sh-Mortalin+PA+DMSO组、Sh-Mortalin+U0126组、Sh-Mortalin+PA+U0126组。使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡率和活性氧(ROS)水平,酶联免疫吸附测定法检测胰岛素水平,Western blotting检测ERK通路相关蛋白[磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶-1(p-Raf-1)]的表达。2组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果体内实验结果表明,与SD组相比,HFD组小鼠胰腺的Mortalin表达明显增加(P<0.01)。体外实验结果表明,与ShNC-Mortalin+PA组相比,Sh-Mortalin+PA组的细胞增殖水平更高,细胞凋亡率更低,细胞ROS水平更低,胰岛素水平更高(P<0.05)。Western blotting结果显示,ShNC-Mortalin和Sh-Mortalin组p-ERK1/2、p-Raf-1蛋白表达均以PA时间梯度降低,且与ShNC-Mortalin组相比,Sh-Mortalin组的p-ERK1/2蛋白水平更高(P<0.05)。与Sh-Mortalin+DMSO组相比,Sh-Mortalin+U0126组EdU阳性率和p-ERK1/2水平均更低,且细胞脂毒性损伤加重(P<0.05)。结论Mortalin参与调控了MIN6细胞的脂毒性损伤过程,且敲低Mortalin可通过激活Raf-1/ERK信号通路减轻PA诱导的MIN6细胞脂毒性损伤。

线粒体融合蛋白2对棕榈酸处理的胰岛β细胞的影响及机制研究

目的探讨线粒体融合蛋白2(Mfn2)对棕榈酸(PA)处理的小鼠胰岛β细胞的影响及机制。方法使用浓度梯度的PA分别处理小鼠胰岛β细胞MIN6细胞,通过CCK8法检测细胞活性,并确定后续实验的PA浓度。通过转染慢病毒构建Mfn2敲低和Mfn2过表达稳定转染细胞系,将MIN6细胞分为Mfn2敲低空载对照(ShNC-Mfn2)组、敲低Mfn2(Sh-Mfn2)组、Mfn2过表达空载对照(OENC-Mfn2)组、Mfn2过表达(OE-Mfn2)组、ShNC-Mfn2+PA组、Sh-Mfn2+PA组、OENC-Mfn2+PA组、OE-Mfn2+PA组。使用小牛血清白蛋白作为PA对照和PA分别处理细胞。使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率、细胞内活性氧簇(ROS)和线粒体膜电位水平,酶标仪检测细胞内ATP水平,实时荧光定量聚合酶链反应与Western blotting法检测Mfn2及凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、半胱氨酸依赖的天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]的mRNA和蛋白表达量。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果与0 mmol/L PA相比,PA浓度为0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 mmol/L时细胞存活率明显下降(P<0.01),选择细胞存活率大概为50%的PA浓度即0.5 mmol/L为后续实验浓度,此时细胞存活率为43.53%±0.56%。MIN6细胞加入0.5 mmol/L PA后,Mfn2 mRNA和蛋白表达量均明显下降(P<0.01)。与ShNC-Mfn2组相比,Sh-Mfn2组Mfn2 mRNA及蛋白表达水平下降(P<0.05);与OENC-Mfn2组相比,OE-Mfn2组Mfn2 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.01)。与ShNC-Mfn2+PA组相比,Sh-Mfn2+PA组的ROS水平显著升高(P<0.01),ATP水平及线粒体膜电位显著下降(P<0.05);与OENC-Mfn2+PA组相比,OE-Mfn2+PA组的ROS水平降低,ATP水平及线粒体膜电位明显升高(P<0.05)。与ShNC-Mfn2+PA组相比,Sh-Mfn2+PA组细胞凋亡率升高(P<0.01);与OENC-Mfn2+PA组相比,OE-Mfn2+PA组细胞凋亡率降低(P<0.01)。与ShNC-Mfn2+PA组相比,Sh-Mfn2+PA组Bax和Caspase-3的mRNA与蛋白表达量显著升高,Bcl-2的mRNA与蛋白表达量显著降低(均P<0.05);与OENC-Mfn2+PA组相比,OE-Mfn2+PA组Bax和Caspase-3的mRNA与蛋白显著降低,Bcl-2的mRNA与蛋白表达量显著升高(均P<0.05)。结论Mfn2可以改善PA诱导的MIN6细胞脂毒性损伤,过表达Mfn2对脂毒性下的MIN6细胞有保护作用,敲低Mfn2会加重脂毒性对MIN6细胞的损伤。