毛皮中6种致病菌基因芯片检测方法的建立和应用

为建立同时检测皮毛中携带的布鲁氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌6种致病菌的基因芯片检测方法,本研究根据NCBI中细菌的16S rDNA和gyrB基因序列,分别设计通用引物和特异性寡核苷酸探针。点样制备检测基因芯片,核酸杂交后,优化并建立同时检测6种致病菌的基因芯片方法。结果表明:使用47%甲酰胺杂交液,42℃摇转杂交4 h为最佳杂交条件。建立的基因芯片方法在多种致病菌之间无交叉反应,检测敏感性可达10拷贝。制备的基因芯片稳定,有效保存期为6个月。该基因芯片对临床样品的检测结果与PCR平行检测结果的符合率为100%。本研究建立的基因芯片检测皮毛中6种致病菌的方法具有高通量、灵敏和特异的特点,为临床皮毛中致病菌的检测和监控提供了新的检测方法。

皮毛中5种病毒基因芯片检测方法的研究

根据GenBank上蓝舌病病毒(BTV)、O型口蹄疫病毒(FMDV)、山羊痘病毒(GPV)、绵羊痘病毒(SPPV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等5种病毒的特异性保守序列,分别设计多重荧光标记引物和相应寡核苷酸探针。使用芯片点样液稀释各探针至终浓度30μmol/L,点样制备11×11阵列芯片。核酸杂交后,建立并优化基因芯片检测方法。结果显示,使用470mL/L甲酰胺杂交液,42℃摇转杂交4h为最佳基因芯片杂交条件。建立的基因芯片检测方法与伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)等无交叉反应,检测敏感性可达20拷贝病毒核酸。制备的基因芯片稳定,保存6个月可用。对151份临床样品进行基因芯片和商业化PCR试剂盒平行检测,两者的符合率为100%。

河南进境毛皮携带致病菌的调查及检测方法的研究

为了掌握河南进境毛皮携带致病菌的种类、性质及研究其检测方法,试验对河南进境的680份毛皮样品进行调查并采用CTAB法、酚氯仿抽提法、Na I-玻璃粉法、Na OH-SDS 4种方法提取、分离细菌基因组,比较核酸提取效果,使用细菌通用16S rRNA引物,PCR扩增细菌核酸,并进行序列测定。结果表明:CTAB法和酚氯仿抽提法能提取出相对完整的基因组片段;Na I-玻璃粉法和Na OH-SDS法不能提取出完整的核酸,但对于复杂环境的样品提取结果满足PCR扩增的需要。酚氯仿抽提法可以作为一种通用的毛皮携带细菌DNA的提取技术,试验建立的细菌PCR结合核酸测序技术可以满足出入境系统快检、快放的要求。

Taqman-MGB探针法检测炭疽杆菌

根据GenBank中炭疽杆菌的主基因组上gyrA基因,毒力因子px01上pagA基因和侵袭因子px02上的CapA基因分别设计引物和对应Taqman-MGB探针,建立了检测炭疽杆菌的实时定量PCR方法。该方法具有良好特异性,仅对炭疽杆菌检测结果为阳性,而与蜡样芽孢杆菌、苏云金杆菌、巨大芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌、链球菌、铜绿假单孢杆菌无交叉反应,检测灵敏度最低可达100copies/μL。对24份皮毛盲样和120份送检样品检测结果表明建立的定量PCR方法与商业化定量PCR试剂盒的符合率为100%。Taqman-MGB探针方法灵敏、特异、重复性好,可应用于炭疽杆菌的快速诊断与监测。