由猪囊胚内细胞团分离胚胎干细胞的研究

以 PMEF为饲养层培养猪 7～ 9日龄囊胚分离 ES细胞 ,ICM初次传代时间为 4～ 7d,ES细胞传代时间为 4～ 5 d,ES细胞传至 1～ 5代的胚胎数分别为 1 2 (1 8.8% ) ,8(1 2 .5 % ) ,5 (7.8% ) ,3(4 .7% ) ,2 (3.1 % ) ,并进行体外分化和 AKP染色鉴定。对影响猪 ES细胞分离与克隆的因素进行比较 ,结果表明 :(1 ) 9和 1 4日龄小鼠胎儿 PMEF饲养层培养 9日龄猪囊胚 ,贴壁率 (83.3% ,88,9% ) ,ICM形成率 (75 .0 % ,77.8% )和 1代 ES细胞克隆率(2 5 .0 % ,2 2 .2 % )无显著性差异 (P>0 .0 5 )。 (2 ) 7,8和 9日龄胚胎随胚龄增加 ,胚胎贴壁率 (5 .9% ,5 7.1 % ,87,9% )和 ICM形成率 (0 .0 % ,2 8.6 % ,81 .8% )升高 ,差异显著 (P<0 .0 1 )。(3) 9日龄囊胚直径 0 .8～ 1 .2 m m培养36～ 4 8h贴壁 ,贴壁率 1 0 0 % ,ICM形成率 1 0 0 % ;直径 >1 .2 mm囊胚贴壁时间为 4 8～ 72 h,贴壁率 5 7.1 % ,ICM形成率 5 7.1 % ,差异显著 (P<0 .0 5 )。去除直径 >1 .2 m m囊胚部分滋养层细胞培养 36～ 4 8h,贴壁率 91 .7% ,ICM形成率 83.3% ;(4 )添加外源 L IF没有提高贴壁率 (86 .4 % ,90 .9% ;P>0 .0 5 )和 ICM形成率 (81 .8% ,81 .8% ;P>0 .0 5 )

异种动物细胞核移植研究现状及相关问题的探讨

随着体细胞核移植相继在多种动物中取得成功 ,异种细胞核移植技术在拯救濒危野生动物、人类干细胞克隆和细胞核质互作研究等方面具有特殊意义 ,受到广泛重视并取得了很大进展。文章对异种细胞核移植技术研究现状进行了综述 ,并对其应用前景和存在的问题进行了探讨。

牛原始生殖细胞的分离与培养

从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。

成年山羊皮肤干细胞体外克隆与诱导分化

目的 探索山羊皮肤干细胞的分离方法与培养体系 ,为进一步研究皮肤干细胞增殖分化的分子机制打下基础。 方法 从成年关中奶山羊耳尖获取皮肤 ,用组织块培养法分离皮肤干细胞 ,碱性磷酸酶 (AL P)染色及体外分化实验鉴定 ,用条件培养基与细胞因子相结合行皮肤干细胞的体外诱导分化。 结果 山羊耳尖皮肤分离得到类干细胞集落并传 5代 ,细胞集落具有典型鸟巢状结构 ,AL P染色阳性 ,体外分化能形成类胚体。在细胞因子 (IGF- 1)及条件培养基的诱导下 ,所分离获取的皮肤干细胞能分化形成类毛囊 ,类星形胶质细胞及类成骨细胞。 结论 用组织块培养法可以获得多能性皮肤干细胞 ;在体外培养条件下不仅能进行定向分化 ,还能进行横向分化。

放射性碘标记RC-160对A549-hSSTR2细胞受体内化及杀伤作用的研究

目的研究^(125)I-伐普肽(RC-160)对转染人生长抑素2型受体(hSSTR2)基因的肺腺癌A549细胞(A549-hSSTR2)受体内化的规律,以及^(131)I-RC-160对 A549-hSSTR2细胞的杀伤作用。方法采用放射性配基结合分析法,以^(125)I-RC-160为放射性配基,测定 A549-hSSTR2细胞及未转染 hSSTR2基因的 A549(A549-pc3)细胞与^(125)I-RC-160在37℃温育不同时间(0.25,0.5,1,4,8,20和24 h)的内化率;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测不同浓度^(131)I-RC-160、Na^(131)I、RC-160对 A549-hSSTR2细胞及A549-pc3细胞作用24,48,72和96 h 的杀伤作用。结果 37℃条件下温育,^(125)I-RC-160迅速与 A549-hSSTR2受体结合并使受体发生内化。在温育1h 时,A549-hSSTR2细胞结合(膜结合+内化)的放射性计数为总计数的(18.2±1.9)%,明显高于 A549-pc3组[(5.7±1.4)%,P<0.01]。1 h 后,A549-hSSTR2细胞膜受体内化率(内化部分放射性计数与总放射性计数比)随时间的延长继续增加,膜结合率(膜结合部分放射性与总放射性计数比)随时间的延长逐渐减少。至24 h 时,受体内化率达(13.0±1.1)%,膜结合率为(3.9±2.2)%。^(131)I-RC-160对 A549-hSSTR2细胞的杀伤作用较对 A549-pc3细胞明显增强,并呈一定的剂量-效应和时间-效应关系,在96 h 时,3700 kBq/ml ^(131)I-RC-160对A549-hSSTR2的抑制率达(78.8±5.9)%。结论 ^(125)I-RC-160可以使转染 hSSTR2基因的细胞膜受体内化;^(125)I-RC-160对 A549-hSSTR2细胞的杀伤作用较强,这为外源性受体基因介导核素靶向性内照射治疗肿瘤提供了实验依据。

卵巢基质动脉血流与优质胚胎关系

目的:探讨卵巢基质动脉血流与体外受精-胚胎移植(IVF-ET)取卵周期优质胚胎的关系。方法:经阴道彩色多普勒B型超声,监测取卵周期月经第2d(M2)和HCG日卵巢动脉血流PI、RI和S/D。根据该周期优质胚胎的数量分成3组:组,无优质胚胎;组,1～3个优质胚胎;组,≥4个优质胚胎,并分析3个组的卵巢动脉血流超声学指标与优质胚胎的关系。结果:M2日和HCG日,3个组的卵巢动脉血流PI、RI和S/D值的波动范围是一致的。M2日、两个组的PI、RI和S/D均低于无优质胚胎组(组)。组与组之间的PI和S/D有显著差异(P<0.05),但组和组之间以及组与组之间的超声指标统计学差异不显著(P>0.05)。HCG日,组与组之间的RI和S/D有显著差异(P<0.05);组与组的PI、RI和S/D值亦有显著差异(P<0.05);但组和组的卵巢动脉血流超声指标差异不显著(P>0.05)。结论:卵巢动脉血流PI、RI和S/D与体外受精-胚胎移植周期胚胎的质量密切相关,可作为预测胚胎质量的有效指标。

昆明小鼠原始生殖细胞无血清培养基的筛选

【目的】筛选体外培养昆明小鼠原始生殖细胞（PGCs）的最佳无血清培养基,为昆明小鼠胚胎生殖细胞（EGCs）建系奠定基础。【方法】以妊娠8.5-12.5 d昆明小鼠PGCs为材料,采用无血清培养基,在培养基中添加不同组分,组成A、B、C、D、E、F、G 7种培养基,对昆明小鼠PGCs进行体外培养,分离培养胚胎原始生殖细胞,以筛选出其最佳培养基。【结果】D、E、F组均能得到较多的小鼠PGCs阳性集落。MEF-CM和GR-CM组的效果与细胞因子组相比差异不显著,但降低了培养基的成本。【结论】在无血清培养基中添加0.1 mmol/L RA或使用条件培养基MEF-CM和GR-CM,均有利于小鼠PGCs增殖。经过EGCs鉴定,本试验得到的细胞是PGCs,并且在各组培养基中均能够形成EGCs集落。

大鼠表皮干细胞的分离培养

为探索一种简单而又高效的分离大鼠表皮干细胞（ESCs）的方法,采用酶消化法和组织块法对大鼠表皮干细胞进行分离、培养;并用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选大鼠表皮干细胞,免疫组织化学方法检测CK15、P63、β1-integrin和α6-integrin表达情况;同时,测定ESCs单细胞克隆与克隆形成率及表皮干细胞生长曲线。结果表明,采用组织块法和酶消化法均能分离得到大鼠表皮干细胞,获得的细胞生长良好,具有较高的克隆形成率,前者可传至第6代,而后者传至3代~4代便分化;干细胞标记物CK15、P63、β2-integrin和α6-integrin均呈阳性;酶消化法和组织块法均能成功地分离、纯化和培养大鼠表皮干细胞,组织块法相对较好。

卵巢动脉血流与卵母细胞回收数量和质量的关系

目的:探讨体外受精-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)控制性超排卵中,卵巢动脉血流与回收卵母细胞数量及其质量的关系。方法:应用前瞻性研究法,随机选择164个超排卵周期,经阴道彩色多普勒B型超声,监测月经第2天(M2)和HCG日卵巢动脉血流S,D,PI、RI和S/D。分析回收卵母细胞数和成熟卵母细胞数与卵巢动脉血流之间的关系。结果:164个超排卵(COH)周期共回收卵母细胞1 714枚,其中成熟卵母细胞1 334枚。根据回收卵母细胞数量和成熟卵母细胞数量分别分成4个组,M2和HCG日,不同回收卵母细胞数4个组的PI、RI和S/D值的波动范围是一致;同样不同回收成熟卵母细胞数4个组的PI、RI和S/D值的波动范围也是一致。但是随着回收卵母细胞数或成熟卵母细胞数的增加,M2和HCG日卵巢动脉血流PI、RI和S/D逐渐降低。结果显示,M2日,当PI<0.62、RI<0.48者,超排卵后可能回收到更多的卵母细胞;而PI<0.60、RI<0.46者,超排卵后可能获得更多的成熟卵母细胞。结论:在COH周期中,卵巢动脉血流与回收卵母细胞数和成熟数密切相关;M2和HCG日,卵巢动脉血流PI、RI值可作为评估超排卵结果的有效指标。

优化成年家兔皮肤上皮细胞核移植有关参数

以成年家兔上皮细胞为核供体,对兔体细胞核移植中孤雌激活、去核、融合、激活及重构胚发育等环节中的有关参数进行筛选和研究.证实160、200和240 V/mm电场强度时的孤雌激活率（77.78%、95.12%、97.30%）无显著差异;200和240 V/mm电场强度时的孤雌激活胚囊胚率（52.94%、48.64%）显著高于160 V/mm时（16.67%）;200和240 V/mm电场强度时的重构胚融合率（82.85%、79.78%）无显著差异;200 V/mm电场强度时的重构胚分裂率（71.69%）显著高于240 V/mm时（56.56%）,裂解率（6.82%）显著低于240 V/mm时（17.92%）.在纺锤体观测仪下,第一极体与纺锤体在一起或相距较近的占60%左右.原核明显的重构胚的分裂率（91.75%）极显著的高于观察不到原核的重构胚（42.86%）.重构胚体外培养发育囊胚率（24.39%）低于受精卵原核胚的体外培养的发育率（86.05%）,但两者同自然交配体内发育的囊胚的细胞数（81±17）差异不显著.将646枚2～4细胞重构胚移植到38只同期化或非同期化的受体后没有幼仔出生.

添加物和消化液对牛和小鼠类胚胎干细胞克隆效率的影响

研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛和小鼠类胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离和克隆 ;在 ES细胞培养液中 ,犊牛血清体积分数以 15 %～ 2 0 %为宜 ,在 DMEM(L )培养液中添加 0 .1μm ol/ L Na2 Se O3+0 .1mm ol/ Lβ-巯基乙醇 +10 ng/ m L IGF+10 0 0 ng/ m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;低糖 DMEM比TCM199和高糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离。优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在37℃用低体积分数消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 。

黄贝平甲胶囊与他巴唑联用对Graves病小鼠细胞因子的影响

目的:观察黄贝平甲胶囊与他巴唑联合应用对毒性弥漫性甲状腺肿(Graves病)小鼠血清中细胞因子水平的影响.方法:用BALB/c雌性小鼠建立Graves病动物模型,在用药物干预后,采用放射免疫分析及夹心ELISA方法检测小鼠血清TT4,TSH,TRAb及细胞因子IL-2,IL-6,TNF-α,IFN-γ水平变化.结果:治疗后黄贝平甲胶囊组小鼠血清中TT4,TRAb水平较模型组明显降低(P<0.05),而TSH水平改变不大,差异无统计学意义;他巴唑组,他巴唑+黄贝平甲胶囊组小鼠血清中TT4,TRAb水平均较模型组显著降低,而TSH水平明显升高(P<0.05);TNF-α,IFN-γ水平变化比模型组显著降低(P<0.05),以联合应用组更为明显,但仍明显高于正常对照组(P<0.05).联合应用组与模型组相比IL-2有所升高(P<0.05);联合应用组与模型组相比IL-6明显降低(P<0.05).结论:黄贝平甲胶囊和他巴唑联合应用对Graves病小鼠血清中细胞因子水平有明显的改善作用,较单独使用他巴唑或黄贝平甲胶囊疗效更为有效.

注核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响

目的 :探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠 -小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响。方法 :采用血清饥饿法同步化处理的 SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞 ,常规超排 KM小鼠获得卵母细胞 ,采用盲吸法去核 ,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎 ,6- DMAP+ CCB+乙醇激活重组胚 ,CZB培养液中培养。结果 :电场强度 ( V/cm)和脉冲 ( ms)为 :1 5 0 0 /30 ;1 5 0 0 /40 ;1 80 0 /30 ;1 80 0 /40时 ,融合率为 :81 .5 % ;83.3% ;77.6% ;82 .0 %。直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为 33.1 %和 2 8.9% ,桑椹胚发育率为 1 7.8%和 1 5 .5 %。结论 :电场强度为 1 5 0 0～ 1 80 0 V/cm,脉冲为 30 ms或 40 ms时 ,都能获得较高的融合率 ;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高 。

8 Hz 130 dB次声作用对大鼠肾上腺超微结构的影响

目的 :探讨次声作用对大鼠肾上腺细胞损伤特点及意义。方法 :将雄性SD大鼠 4 2只随机分为对照组和 1、7、14、2 1、2 8和35d实验组 ,实验组在 8HZ 130dB次声环境下每日暴露 1次 ,每次 2h ;取肾上腺组织固定 ,透射电镜下观察肾上腺细胞超微结构变化。结果 :不同环境和天数次声作用后肾上腺皮质细胞可见细胞膜破裂 ,发生变性坏死。其损伤随作用次数增多其损伤逐渐加重 ,2 8、35d组损伤程度有所恢复。各实验组肾上腺髓质细胞超微结构变化不明显。结论 :次声作用可对肾上腺细胞造成不同程度损伤 ,2 8d后肾上腺对次声的损伤作用存在着一定适应现象。

浅谈外科手术学教学体会

外科手术学是培养医学生基本功和手术技巧的重要环节。针对外科手术学教学中面临的一些实际问题,笔者从提高对课程重要性的认识、强化教师的楷模作用、加强对教学设施的建设、建立规范化教学模式、利用现代化教学手段、加强学生的基本操作训练、完善课后考核制度等多方面进行了一系列探索,取得了一定的成效。

泽黄颗粒对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用

目的探讨泽黄颗粒对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其可能机制。方法以高糖高脂饮食联合低剂量链脲佐菌素(STZ)注射方法制作2型糖尿病动物模型。将SD大鼠分为对照组、模型组和治疗组,治疗组将泽黄颗粒给大鼠灌胃;对照组及模型组给予同等剂量的纯化水。6个月后进行肾脏形态学和生化指标的检测,用放免法检测血清血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)、血清和肾组织内皮素(ET)的水平,用免疫组织化学方法测量肾组织局部转化生长因子β1(TGF-β1)的表达。结果治疗组大鼠的肾功能及肾脏病变明显改善;血清Ang-Ⅱ、血清和肾组织ET水平降低;肾组织局部TGF-β1的表达减少。结论泽黄颗粒对2型糖尿病大鼠的肾脏有保护作用,其机制可能与降低血清Ang-Ⅱ、ET,肾组织ET和TGF-β1水平有关。

基于软弱围岩地质条件的高等级公路隧道施工方法

为解决在软弱围岩地质条件下的高等级公路隧道围岩拱顶变形量较大的问题,通过计算公路隧道软弱围岩的可承受压力与地基的临界埋深距离,设计一种适用于软弱围岩地质条件下的高等级公路隧道施工方法。经施工应用成果表明,施工后的公路隧道围岩拱顶最大变形值为19.67mm,保持在控制数值范围内,表明设计的施工方法切实可行。

小鼠视网膜神经上皮层移植后诱发免疫排斥和赦免反应的观察

目的 观察眼内不同部位移植视网膜神经上皮层后诱发的免疫排斥 /赦免反应。方法 将新生小鼠视网膜神经上皮层分离后移植到受鼠眼结膜下、玻璃体腔和视网膜下间隙 ,术后 2、6、12、18、35 d用光镜观察移植物的存活 /排斥情况。结果 位于结膜下移植物 2 d内发生排斥反应 ,而位于玻璃体腔和视网膜下间隙的移植物不仅未被排斥 ,而且能进一步生长发育。

流式细胞仪分析法检测黑熊成纤维细胞周期同步化处理效果

分离培养黑熊皮肤成纤维细胞 ,传 3代 ,分别经血清饥饿 2～ 6 d和 10 g/ L Nocodazole处理 2 4 h后 ,用流式细胞仪分析 2个处理组和对照组细胞的周期相 ,以研究黑熊成纤维细胞同步化处理后的细胞周期时相的变化 ,探讨核移植供体细胞的细胞周期对核移植胚胎发育的影响。结果显示 ,血清饥饿组、Nocodazole处理组及对照组的 G0 +G1 期成纤维细胞的百分率分别为 (85 .0 5± 7.0 0 ) % ,(4 5 .9± 3.7) %和 (5 9.3± 6 .7) % ;G2 / M期细胞的百分率分别为 (10 .4± 6 .8) % ,(4 6 .3± 4 .2 ) %及 (2 3.0 5± 1.0 5 ) %。表明血清饥饿法能较好地使黑熊成纤维细胞同步于 G0 和 G1 期 ;Nocodazole处理可以使细胞较大程度同步于 G2 和 M期。

大鼠成纤维细胞同步处理的流式细胞仪分析

目的 :研究 SD大鼠成纤维细胞同步处理后的各细胞周期的变化 ,探讨供体细胞的细胞周期对核移植胚胎发育的影响。方法 :分离培养 SD大鼠皮肤成纤维细胞 ,传 3～ 5代 ,分别经血清饥饿 2～ 6d和 1 0 mg/ ml nocodazole处理 2 4 h,流式细胞仪分析处理组和对照组的细胞周期百分比。结果 :血清饥饿、nocodazole处理及对照组的 G0 + G1期成纤维细胞的百分比 ( % )分别为 74.5± 4.4、49.5± 4.65和 5 0 .1 2± 3.9;G2 / M期细胞的百分比 ( % )分别为 :1 9.2 5± 4.2、2 5 .98± 2 .7及 45 .9± 5 .2 1。结论 :血清饥饿能较好地使大鼠成纤维细胞同步于 G0 和 G1期 ;nocodazole处理则使细胞较大程度同步于 G2 和 M期。