组培和大棚培育下肇庆地区金线莲总黄酮含量分析

基于乙醇提取法和正交试验分析组织培养和大棚培育2种种植方式下肇庆金线莲总黄酮提取工艺,比较不同生长周期下金线莲总黄酮的含量变化。采用乙醇提取法,考察乙醇浓度、液料比和提取温度对不同种植方式金线莲总黄酮得率的影响。随后通过正交试验进行分析最优的提取工艺,验证后使用此条件测定不同月龄金线莲总黄酮含量。金线莲总黄酮最优组合为料液比1∶30 g/mL、水浴温度70℃、乙醇浓度80%,验证试验总黄酮得率为1.926%(RSD=1.11%,R2=0.992)。金线莲总黄酮含量与月龄有关,随着月龄的增加,2种种植方式的金线莲总黄酮含量逐渐上升,7月龄时达到最高值。优化的乙醇提取工艺可在不同种植方式下的肇庆金线莲中稳定萃取总黄酮,并在7月龄时达到最大值,为金线莲活性成分分析和总黄酮质量评价提供参考。

温度对黑斑蛙蝌蚪的生长发育和适应性影响

为探究温度对黑斑蛙蝌蚪生长发育和适应性的影响。将黑斑蛙蝌蚪分别在7、17℃和27℃驯化温度下饲养,测定体重、全长、尾长和体宽4个形态指标,分析各项形态指标的变化以及最适温度、逃避温度和致死温度的研究。结果显示,在饲养1~7 d期间,27℃组的体重、体宽、全长增长率均高于17℃组。在7、17、27℃驯化条件下,其最适温度分别是28.44、30.03、30.70℃;其逃避温度分别为25.49、31.77、31.78℃;其高温致死温度范围是38.0~40.5℃。综合结果分析表明,27℃是黑斑蛙蝌蚪比较适合的饲养温度,不同温度驯化后的蝌蚪,其最适温度有明显差异(P<0.05),逃避温度存在显著差异(P<0.01),而其高温致死温度没有显著差异性(P>0.05)。通过调节驯化温度,能够提高黑斑蛙蝌蚪对环境温度的适应性。

一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化

为了解猪流行性腹泻病毒广东流行株的S1基因流行变异情况,制备相应的诊断试剂,试验采用RT-PCR从猪流行性腹泻疑似发病仔猪的肠道内容物中扩增获得S1基因,利用生物信息学软件构建S1基因的遗传进化树.将S1基因克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1,转化至DH10Bac感受态细胞中,经抗生素筛选重组杆粒,把重组杆粒转染到昆虫细胞Sf9,盲传3代后进行间接免疫荧光试验和Western blot鉴定.结果表明:该猪流行性腹泻病毒广东流行株分布于GII-b分支,与国内猪流行性腹泻病毒分离株(HN-HB1-2018、HBHA2015)的核苷酸相似性为98.0%~98.3%,而与猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777、DR13的核苷酸相似性仅为89.9%~90.0%.且S1重组蛋白可在昆虫细胞Sf9中以细胞培养分泌上清的形式表达.本研究可为猪流行性腹泻病毒的流行现状研究提供参考,以及后续猪流行性腹泻病毒诊断制品的研发提供前期基础.

非洲猪瘟病毒p30蛋白在293T细胞中的瞬时表达

为真核表达非洲猪瘟病毒p30蛋白,探究其对炎症反应相关基因表达的影响.实验根据NCBI上的p30基因序列合成基因,将其克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,再将重组质粒转染到293T细胞中,培养24 h后通过荧光显微镜观察质粒的转染情况,以western blots试验检测目的蛋白的表达情况,最后再利用RTqPCR检测过表达p30蛋白的293T细胞中NF-κB信号通路和炎症反应相关基因的mRNA转录情况.结果显示,293T细胞转染重组质粒24 h后,约80%的细胞可显示绿色荧光,并且western blots检测到一条可与Flag标签抗体特异性反应的条带,大小与预期相符.RT-qPCR试验表明,过表达ASFV p30蛋白的293T细胞中,炎性反应相关细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平得到显著上调,上调倍数为对照组的2.988~3.605倍.试验可为ASFV抗原抗体检测技术的研发提供前期基础,为ASFV分子致病机制研究提供参考.

线上线下混合式教学在分子生物学实验教学中的应用

为了提高分子生物学实验课的教学效果,充分利用网络教学平台,掌控“课前”“课中”和“课后”3个教学环节,开展分子生物学实验“线上线下”混合式教学改革实践.具体通过“课前线上自学+课中线下实操/课堂交流+课后线上复习”的教学设计,使用“教师布置任务—学生线上自学—线下学生课堂实操+教师具体指导—虚拟实验平台反复练习+学生线上自学自测”的教学方式,达到提高学生学习的主动性、积极性和综合素质的目的.

不同时相中微管蛋白对细胞周期蛋白的调控作用

在所有真核生物中微管主要以结构性骨架蛋白存在,参与有丝分裂、细胞运动和细胞内运输等关键的细胞过程。在动物细胞中,微管在不同时相中聚合或解聚的周期性转变可以影响纺锤体的形成和细胞的分裂,调控细胞周期的进程。该文主要总结细胞周期不同时相中哺乳动物微管蛋白在不同处理条件下的变化,分别阐述微管蛋白在细胞周期的G0期、S期和G2/M期的重要作用,进一步地完善微管蛋白在哺乳动物细胞周期中的功能,为以后分析微管在细胞周期特定阶段中的作用提供参考依据。

H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化

【目的】真核表达H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Westernblots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBRgreen染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9盲传3代后,Sf9开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64质粒为标准,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在1×103~1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10MOI的比例接种Sf9,孵育72h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4log2。【结论】本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIVHA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考。

精子功能相关的蛋白质调控受精过程的研究进展

哺乳动物的受精过程涉及到精子一系列的功能活动,如精子在雌性生殖道的运行、精子的超活化与获能、顶体反应以及精卵融合等。在精子经历的这一系列过程中,精子功能相关的蛋白质发挥着不可或缺的作用,这些蛋白分子的正常与否与雄性个体的繁殖力高低密切相关,因此精子功能相关的蛋白质能够作为评定哺乳动物精液受精能力的生物标记。文章主要对哺乳动物精子功能相关的蛋白质进行了综述,以阐述相关蛋白分子对精子运动活力、精子获能、顶体反应、透明带穿入和精卵融合等方面的重要作用以及这些蛋白分子在家畜遗传改良上的潜在应用。

季节性差异对基础母猪群繁殖性能的影响

以母猪的配种、分娩季节为研究对象,应用单因素方差分析和多重比较等统计方法对213 321条配种记录和160 545条分娩记录进行分析,以探索季节性差异对基础母猪群繁殖成绩的影响。结果表明,冬季配种的母猪分娩率和窝产总仔数最高,分别为76.51%和10.66头,极显著高于春、夏两季配种母猪(P<0.01);其中冬季配种杜洛克、大白母猪和秋季配种长白母猪的窝产总仔数为同品种配种季节对比中最高,分别为9.85头、10.92头和10.52头。另外,春季分娩的母猪窝产总仔数为10.65头,窝产活仔数为9.43头,均极显著高于夏、秋两季(P<0.01);其中春季分娩杜洛克、长白、大白母猪窝产总仔数为同品种分娩季节对比中最高,分别为9.75头、10.62头、10.92头。因此,杜洛克和大白母猪在冬季配种时表现的繁殖性能最佳,长白母猪在秋季配种时可获得最优的繁殖成绩;妊娠阶段在气候温和的冬-春季,分娩时间在春季的母猪产仔性能更好。

左旋肉碱对猪卵母细胞体外成熟、脂肪代谢和孤雌胚胎发育的影响

【目的】探讨不同质量浓度的左旋肉碱对猪卵母细胞体外成熟、脂肪代谢和孤雌胚胎发育的影响.【方法】在成熟培养液中添加不同质量浓度左旋肉碱,观察其对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响,并利用油红染色、三酰甘油定量试剂盒和定量RT-PCR技术检测其对卵母细胞脂肪代谢及其关键水解酶表达水平的影响.【结果和结论】在成熟液中添加100 ng/mL左旋肉碱能极显著促进猪卵母细胞的脂肪滴代谢(P<0.001),并显著提高猪卵母细胞体外成熟率和孤雌激活囊胚发育率(P<0.05);在胚胎培养液中添加100 ng/mL左旋肉碱能够显著提高猪孤雌胚胎卵裂率(P<0.05),其囊胚率和囊胚质量均有提高的趋势;通过定量RT-PCR进一步发现100 ng/mL左旋肉碱极显著降低猪卵母细胞中激素敏感脂肪酶基因(HSL,P<0.01)和三酰甘油水解酶基因(ATGL,P<0.001)的mRNA表达水平,表明左旋肉碱能够影响调控脂肪代谢关键酶基因的表达.试验结果表明,左旋肉碱具有促进猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎发育能力的作用,其可能是通过调控脂肪代谢来实现的.

出生季节对公猪繁殖性能的影响

以公猪出生季节为研究对象,应用单因素方差分析和多重比较等统计方法对广东地区的1 736头公猪数据进行分析,以探索季节性差异对公猪繁殖性能的影响。结果表明,冬季出生的公猪使役寿命达到16.04个月,配种母猪的分娩率为76.35%,繁殖效率值为8.04头/胎,与春季出生的公猪相比差异不显著(P>0.05),但显著或极显著高于夏、秋两季出生的公猪。此外,冬、春季出生杜洛克公猪的配种母猪分娩率分别为76.85%和77.41%,两者差异不显著(P>0.05),但均显著高于夏季和秋季出生的公猪(P<0.05);冬、春季出生长白公猪的使役寿命最长,分别为16.90个月和16.16个月,两者差异不显著(P>0.05),但均极显著高于夏、秋季出生的公猪(P<0.01);冬、春季出生大白公猪的使役寿命分别为15.03个月和15.04个月,两者差异不显著(P>0.05),但均显著高于夏、秋季出生的公猪(P<0.05)。因此,选育冬-春季节出生的公猪是提升基础母猪群繁殖效率的有效途径。

公猪繁殖障碍的表现与致病机理

公猪繁殖障碍是当今养猪业生产中普遍存在的问题,其表现为公猪繁殖能力的下降或缺失。公猪繁殖障碍病主要由传染性因素和非传染性因素造成的,其中由传染性因素引起的繁殖障碍主要是病毒或病菌侵染公猪睾丸所引起的,如乙脑病毒、布氏杆菌、猪衣原体、伪狂犬病病毒等;而非传染因素引起的则多与营养、饲养管理、热应激以及受精相关蛋白含量有关。为了更好地避免公猪繁殖障碍,从繁殖障碍的表现、致病因素及致病机理等方面进行了概述,以供养猪管理人员参考。

骨桥蛋白OPN在哺乳动物生殖上的作用及在生猪生产应用上的展望

骨桥蛋白(osteopontion,OPN)是细胞外基质中的一种分泌性糖基类酸性蛋白质,富含天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸。有研究表明,骨桥蛋白在雌性、雄性哺乳动物生殖系统中广泛表达,与哺乳动物的生殖机能息息相关。它不仅影响子宫内膜容受性的建立、胚胎的着床,且在精卵融合过程中发挥着至关重要的作用。就OPN在哺乳动物生殖上的相关作用和机理进行了综述,并对该蛋白今后在生猪生产上的应用进行展望。

基于TAIL-PCR分析外源基因在小鼠精原细胞中的整合位点

外源基因在哺乳动物细胞的整合位点会影响宿主细胞的生殖发育,在基因功能研究中常常会先确定其整合的染色体位置.为研究外源基因在小鼠精原细胞中的整合位点,以转入Cas9基因的小鼠精原细胞为研究材料,通过TAIL-PCR克隆Cas9整合到基因组的旁侧序列,结合T载体连接和碱基测序技术在有限的基因组中检测Cas9整合到小鼠基因组的具体位置.结果表明,转入外源基因的小鼠精原细胞折光性好,生长良好,PCR扩增发现Cas9基因成功转入到小鼠精原细胞的基因组上;结合上游特异性引物和简并引物可扩增出2条特异性条带,测序发现均为载体序列;结合下游特异性引物和简并引物可扩增出4条特异性条带,其中有2条扩增片段属于载体序列,2条扩增片段为小鼠基因组12号染色体中的序列.这表明外源基因整合到小鼠精原细胞12号染色体上.

以茶叶渣为例探讨厨余垃圾中色素的提取工艺

为了探讨适合茶叶渣的色素提取工艺,首先,通过光波扫描寻找适宜的可见光检测波长;随后,设计单因素实验找出最佳的温度、料液比、时间和浓度;最后,利用L_(9)(3^(4))正交试验优化提取工艺。结果发现,茶叶渣色素最大吸收波长为665 nm;单因素试验发现提取茶叶渣色素最佳效果为:温度80℃、料液比1:10、提取时间120 min和乙醇浓度80%;通过正交实验优化后,提取茶叶渣最优工艺为85℃的提取温度、1:5(g/mL)的料液比、135 min的提取时间和100%的提取液浓度,并检验试验也证实该条件下茶叶渣色素提取效果最佳。

初探lncRNA-Tubb4b的蛋白编码能力及其对微管基因的调控

旨在探索长链非编码Tubb4b基因(lncRNA-Tubb4b)是否具有蛋白编码能力及其对Tubb4b基因的调控作用。本研究在lncRNA-Tubb4b中添加起始密码子ATG、0/1/2个的T尾和Flag标记,通过构建载体、脂质体转染和Western blot等技术对lncRNA-Tubb4b蛋白编码能力进行分析;随后,构建过表达载体和合成siRNA,通过脂质体转染和实时荧光定量PCR等技术检测lncRNA-Tubb4b对微管基因Tubb4b的影响。结果表明,我们扩增了添加0、1和2个T尾的Flag片段,其与lncRNA-Tubb4b融合后,成功构建到pcDNA3.1(-)载体中;转染小鼠精原细胞后发现,添加0、1和2个T尾的lncRNA-Tubb4b均没有FLAG蛋白条带;以pcDNA 3.1(-)-EGFP载体为对照,在小鼠精原细胞中过表达lncRNA-Tubb4b时,对照组细胞有荧光产生,试验组Tubb4b基因的mRNA表达水平极显著地降低(P<0.01);在小鼠精原细胞中干扰lncRNA-Tubb4b表达后,极显著地提高Tubb4b基因的mRNA表达水平(P<0.01)。这表明,lncRNA-Tubb4b确实不编码蛋白质,过表达或干扰lncRNA-Tubb4b的表达会极显著地降低或升高Tubb4b基因的表达。