2013-2021年实验动物质量检测能力验证情况

目的分析我国实验动物质量检测能力现状,探讨实验动物质量检测能力验证组织实施现状,研究影响能力验证满意率的关键因素。方法通过Excel2010和Powerpoint2010软件进行实验室数量、项次、满意率以及频次的变化分析。结果2013—2021年共实施27个能力验证计划,包括22种检测能力参数,发放92种生物样本。共有70家实验室参加552个项次,整体满意率达到90.22%。结论持续参加能力验证活动可以提升实验室的检测能力。

从腹泻实验兔分离的一株大肠埃希菌的生物学特性研究

目的研究从腹泻实验兔分离到的大肠埃希菌的生物学特性。方法对一株从因腹泻而死亡的SPF级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌的遗传谱系、抗生素敏感性、消毒液敏感性以及细菌携带的耐药基因和毒力基因进行较为全面的研究。结果该大肠埃希菌属于B1型遗传谱系,携带毒力基因eaeA,属于肠致病性大肠埃希菌。对常用的5种消毒液敏感,对于青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、米诺霉素、红霉素、麦迪霉素、万古霉素、复方新诺明等11种抗生素耐药,携带aadA1,gyrA,sul1和tetA等4个抗生素耐药基因。结论从因腹泻而死亡的SPF级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌为一株B1型遗传谱系的肠致病性大肠埃希菌,具有多重耐药性,对常用的消毒剂均敏感。

实验动物金黄色葡萄球菌的实验室检测能力验证结果评价

目的通过实施实验动物金黄色葡萄球菌检出能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,通过低温冻干制备样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果共有28个实验室参加本次能力验证项目,其中获得满意验证结果的实验室为22个,占总参加机构的78.57%;未得到满意验证结果的实验室为6个,占21.43%。采用国标检测方法的有27个,采用PCR检测方法的有1个。结论实验动物质量检测机构对金黄色葡萄球菌的检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。

实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。

普通环境长爪沙鼠肠道菌群的分离鉴定

目的调查普通环境长爪沙鼠肠道菌携带情况,为制定长爪沙鼠微生物学等级标准提供依据。方法对普通饲养环境的65只长爪沙鼠进行解剖,取回盲部内容物接种于6种不同培养基,分离菌株后同时进行生化分析和PCR测序鉴定,以期准确判断分离菌株所属菌属,并分别计算检出率。结果用6种培养基组合进行肠道菌群的分离大大提高了细菌的检出率。本研究共检出37种细菌,不同细菌感染率相差很大,阳性率在1/65(1.5%)到60/65(92.3%)之间,其中部分细菌为大鼠和小鼠致病菌。结论本研究为长爪沙鼠的微生物学等级标准的制定提供了参考数据。

应用实时荧光定量PCR方法检测实验用猫巴尔通体的感染

目的建立高效特异的巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法,并应用于实验用猫的微生物检测工作中。方法针对NCBI公布的巴尔通体序列设计特异引物和Taq Man探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对142个猫样品进行检测。结果成功建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为1.0×101copies/μL^1.0×109copies/μL,相关系数为0.998,检测极限达10 copies/μL;特异性结果显示所建方法具有良好的特异性,并在142份实验用猫样品中检测出阳性样品6份。结论实时荧光定量PCR方法可用于实验用猫巴尔通体的检测工作中。

SIVmac251不同途径感染恒河猴急性期实验研究

目的建立SIV黏膜感染的恒河猴模型,并与静脉感染相比较,研究不同途径感染后病程进展是否存在差异。方法用SIVmac251经静脉、阴道、直肠3种途径分别感染恒河猴,定期采血,进行全血病毒分离,测定血浆病毒载量、CD4+/CD8+比值及抗体检测。结果感染后7d至目前56d为止,外周血单核淋巴细胞中前病毒DNA检测、全血病毒分离全部呈现阳性,只有直肠感染猴S172在7d和42d时出现较高病毒滴度;血浆病毒载量检测阳性出现先后顺序为静脉感染、直肠感染、阴道感染,14d达到高峰,然后迅速下降,变化趋势基本保持一致。血浆抗体检测从第14天开始3种途径感染的恒河猴体内抗体均为阳性;感染后CD4+/CD8+比值下降,在第28天时出现比例倒置。结论经不同途径均成功感染恒河猴后在病毒分离和血浆病毒载量等方面表现出了一定的差异。

应用PCR方法对三种新型实验动物钩端螺旋体感染情况的调查研究

目的建立有效的钩端螺旋体PCR检测方法,并对树鼩((tree shrew,Tupaia belangeri))、长爪沙鼠(Meriones unguiculatus;Mongolian gerbil)和灰仓鼠(Cricetulus migratorius)等三种新型实验动物进行感染情况调查。方法针对NCBI公布的钩端螺旋体序列,设计并筛选特异性引物,优化PCR体系,进行特异性和敏感性测试;并运用优化PCR方法对树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠样品进行检测。结果成功建立钩端螺旋体PCR检测方法,序列测定验证了该方法的特异性。普通级树鼩钩端螺旋体的阳性率为8.33%,普通级长爪沙鼠钩端螺旋体为100%,清洁级长爪沙鼠和清洁级灰仓鼠钩端螺旋体的阳性率为0%。结论本研究建立了钩端螺旋体PCR检测方法,调查了树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠三种新型实验动物的感染情况,为这三种实验动物的研究和使用奠定基础。

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立

目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipa H基因及空肠弯曲菌gyr A基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp)。该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌)。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。

实验犬布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定

目的建立实验犬及相关生物制品布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定方法。方法选择布氏杆菌Omp2基因同源性较高的区域设计引物对布氏杆菌进行多重PCR扩增,扩增结果一致的样本进行酶切以区分不同型,同时进行序列测定,以确定该方法的准确性;然后验证该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增得到目的条带,并通过酶切区分五种布氏杆菌;PCR产物与布氏杆菌DNA序列同源性达到99%,并验证了该方法的检测结果。实验结果证明该方法特异性较好,灵敏性为1.8×10-7μg/mL。结论成功建立布氏杆菌多重PCR检测与分型鉴定方法,所建立的方法特异性好,灵敏度高。本研究对保证实验犬群的质量,保护饲养人员、实验人员的身体健康具有重要意义。

普通环境长爪沙鼠呼吸道菌群的分离鉴定

目的调查普通环境长爪沙鼠呼吸道细菌及支原体携带情况,为制定长爪沙鼠微生物学等级标准提供依据。方法对普通环境饲养的65只长爪沙鼠进行解剖,取气管分泌物接种血琼脂,分别放入普通培养箱和5%CO2培养箱中培养48 h,分离菌株后同时进行生化分析和PCR测序鉴定,以期准确判断分离菌株所属菌属;气管浸液提取DNA,用支原体特异性引物进行PCR检测,并分别计算检出率。结果本研究共检出22种细菌及支原体。不同细菌、支原体感染率相差很大,阳性率在1.5%(1/65)到64.6%(42/65)之间,其中部分细菌为大鼠和小鼠致病菌。结论本研究为长爪沙鼠的微生物学等级标准的制定提供了参考数据。

实验动物布鲁杆菌PCR检测方法团体标准的编制

布鲁杆菌病是一种人畜共患的传染病,病原为布鲁杆菌,该菌是实验动物必需排除的微生物之一。随着时间的推移、条件的变化及技术的进步,原有检测方法和标准已明显不适用于检测现状,需要制定新的实验动物布鲁杆菌检测方法和标准。本文介绍实验动物布鲁杆菌PCR检测方法团体标准的编制背景、法律依据、内容编制、及未来展望等内容,以便于相关人员更好的理解该标准,更好地进行实验动物布鲁杆菌的检测。本团体标准的编制完成进一步完善了实验动物相关标准,为保障实验动物质量,适应我国实验动物国际化发展的需求提供了技术支持。

猴副流感病毒5型实时荧光定量PCR方法的建立与初步应用

目的建立猴副流感病毒5型（SV5）实时荧光定量PCR方法，并初步应用于猴样本检测。方法根据SV5病毒NP基因保守片段设计特异引物和TaqMan探针，使用分子生物学方法制备质粒标准品，建立SV5实时荧光定量PCR方法；对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定；并使用该方法对24个猴样品进行检测。结果成功建立SV5实时荧光定量PCR方法；该方法线性范围为（6．8×10^9～6．8×10^5）copy／μL，灵敏度为6．8copy／μL，批内变异系数（CV）为0．63％～8．71％，批间CV为1．52％-12．38％，而且方法特异性好；在24个猴肺样品中未检测出阳性。结论该方法的建立为实验动物和动物源性生物制品中SV5的定量检测奠定了基础。

实验动物小肠结肠炎耶尔森菌的实验室检测能力验证结果评价

目的 通过实验动物小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)检出能力验证,了解实验动物检测机构的检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法 按照中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity, CNAS)批准的能力验证方案,低温冷冻干燥制备样品;稳定性和均匀性检验合格后,通过CNAS平台随机分组编号,发放给参加单位,并附作业指导书。要求在规定时限提交检验报告和原始记录,其结果与样品设置一致的判为满意结果,不一致或未按时提交的判为不满意结果。结果 共有24个实验室参加本项能力验证;其中获得满意结果的实验室为22个,占总参加机构的91.7%;得到不满意结果的实验室有2个,占8.3%。结论 实验动物质量检测机构对小肠结肠炎耶尔森菌的检测能力较高。

实验动物四种呼吸道病原菌实验室检测能力验证结果分析

目的通过实施实验动物支气管鲍特杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、多杀巴斯德杆菌和鼠棒状杆菌检测能力验证活动,达到评估实验动物检测机构的检验能力,提高实验动物质量检测水平的目的。方法2021年和2022年按照中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment,CNAS)相关准则设立NIFDC-PT-309和NIFDC-PT-363两个项目(分别检测实验动物样品中呼吸道病原菌支气管鲍特杆菌/嗜肺巴斯德杆菌、鼠棒状杆菌/多杀巴斯德杆菌),开展能力验证活动。制备4种实验动物呼吸道病原菌和阴性对照大肠埃希菌的冷冻干燥样品;均匀性和稳定性检验合格后,随机分组编号,将样品发放给参加单位,要求在规定时限提交检验报告和原始记录。反馈的结果与样品设置一致的判定为满意结果,不一致或未按时提交的判定为不满意结果。结果2021年共有29家实验室参加了NIFDC-PT-309项目,获得满意结果的实验室为27个,满意率为93.1%。2022年共有30家实验室参加了NIFDC-PT-363项目,满意率为100%。结论国内大多数实验动物质量检测机构具备较强的呼吸道病原菌检测能力,并且通过开展能力验证活动这一检测能力正在稳步提升。

HIV疫苗实验研究的现状

目的研制免疫原性好、安全性高、有效的疫苗是控制HIV传播感染的重要手段之一。我国学者也开展了不同疫苗的研制工作,取得一定的效果。本文主要描述了HIV疫苗的两个种类,即预防性疫苗和治疗性疫苗,包括采用传统疫苗技术研制的减毒活疫苗和灭活疫苗以及采用现代生物技术研制的重组蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗等,以期对疫苗研究开发提供思路和参考。

PCR技术在小鼠CAR杆菌检测中的初步应用

目的 建立有效的CAR杆菌（Cilia-associated respiratory bacillus）PCR检测方法,并进行初步应用.方法 针对NCBI公布的CAR杆菌序列,选取大小合适的序列,合成质粒,并设计特异性引物,对实际样品进行检测,扩增出的阳性片段进行测序,验证该方法的可靠性.结果 成功建立了CAR杆菌的PCR检测方法,初步应用验证了该方法的可靠性.结论 该方法的建立为实验动物CAR杆菌的检测奠定基础.

树鼩巴尔通体PCR方法的建立及初步应用

目的建立有效的树鼩巴尔通体PCR检测方法,并进行初步应用。方法针对NCBI公布的巴尔通体序列设计3对引物,通过对我国主要流行菌株的扩增实验来确定1对引物,并进行体系优化、特异性和敏感性测试;运用该PCR方法对60份树鼩样品进行检测,阳性样本进行序列测定。结果所建树鼩巴尔通体PCR检测方法特异性良好,灵敏度较高(2.0×10-5μg/mL),60份树鼩样本中有15份阳性样本,通过序列测定证实树鼩巴尔通体感染率为25%,与扩增结果完全相符,验证了该方法的可行性。结论该方法的建立为树鼩巴尔通体的检测奠定了基础。

抗原热灭活对小鼠肺炎支原体ELISA检测的影响

目的优化小鼠肺炎支原体ELISA检测方法,降低非特异性反应。方法肺炎支原体热灭活处理后制备ELISA板,检测小鼠血清,与常规ELISA及分离培养方法相比较。结果优化后的ELISA方法平均本底值为0.03,敏感度为1:1280;优化ELISA方法与分离培养方法的符合率为99.27%,比常规ELISA方法高;PCR验证改进后的ELISA方法具有较好的准确性。结论优化后的方法准确性好,灵敏度高,对小鼠肺炎支原体的检测具有重要的实际意义。

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。