过表达ADH1B基因HepG2.2.15细胞株的建立

目的构建ADH1B慢病毒表达载体并建立ADH1B稳定过表达的人肝癌细胞株HepG2.2.15。方法根据ADH1B基因序列设计引物,PCR扩增并连接于GV492载体质粒交换转化DH5α感受态,选取阳性克隆转化子进行测序鉴定。采用三质粒系统包装ADH1B慢病毒载体转染293T细胞收集上清,测定滴度。感染人肝癌细胞HepG2.2.15,嘌呤霉素筛选得到过表达ADH1B的稳定细胞株,设立空白组、阴性对照组和过表达组,通过荧光显微镜观察各组GFP表达情况,并用Western blot及RT-qPCR从蛋白、mRNA水平对ADH1B基因表达进行检测。结果通过PCR、酶切鉴定及基因测序成功构建ADH1B过表达慢病毒载体,检测病毒滴度为2×109TU·mL-1。利用此病毒悬液感染HepG2.2.15细胞,成功筛选到ADH1B稳定表达的HepG2.2.15细胞株。Western blot及RT-qPCR结果显示:重组慢病毒载体LV-ADH1B能够有效感染HepG2.2.15细胞,与空白组和阴性对照组细胞相比,在过表达组细胞ADH1B m RNA和蛋白中表达量均升高。结论成功构建ADH1B基因的重组慢病毒载体LV-ADH1B,并筛选出稳定过表达ADH1B基因的人肝癌细胞株HepG2.2.15。

慢性乙型肝炎患者血清IP-10对肝损伤及纤维化辅助诊断价值

目的探讨血清干扰素γ诱导蛋白10(IFN-gamma-inducible protein 10,IP-10)在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)中的临床意义。方法共84例未经治疗的CHB患者和30例健康对照者被纳入研究。收集所有调查对象的年龄、性别、病史、血清HBV DNA水平、肝功能、肝脏硬度检测值(LSM)。通过ELISA方法检测血清IP-10水平,分析血清IP-10水平与其他指标的相关性;采用ROC曲线评价血清IP-10水平对CHB的诊断价值。结果CHB患者血清IP-10水平[(277.61±250.27)ng·mL-1]高于健康对照组[(29.94±16.90)ng·mL-1](t=8.996,P=0.0001)。CHB患者中血清IP-10水平在HBsAb和HBeAb阳性者高于阴性者,TBIL异常者高于正常者(P均<0.05);不同程度肝硬化和肝损伤CHB患者,血清中IP-10水平差异均有统计学意义(P均<0.01)。血清IP-10与LSM、AST、TBIL呈正相关,与HbeAb呈负相关(P均<0.01)。IP-10在本组数据中诊断AUC分别为:CHB发病0.938(0.896~0.981)(P=0.000),轻度肝损伤0.850(0.768~0.932)(P=0.000),中度肝损伤0.529(0.390~0.669)(P=0.738),重度肝损伤0.827(0.740~0.913)(P=0.000),轻度肝纤维化0.763(0.666~0.861)(P=0.001),中度肝纤维化0.533(0.415~0.651)(P=0.696),重度肝纤维化0.762(0.663~0.860)(P=0.003),肝硬化0.851(0.761~0.942)(P=0.000)。结论血清IP-10水平与慢性乙型肝炎所致的肝损伤及肝纤维化相关,具有潜在辅助诊断价值。

MicroRNA-519d-3p对肝星状细胞活化及凋亡的影响

目的探讨微小RNA-519d-3p(microRNA-519d-3p)对LX-2(人肝星状细胞株)活化及凋亡的影响。方法将miR-519d-3p分子模拟剂(miR-519d-3p mimics组)、抑制剂(miR-519d-3p inhibitor组)及其阴性对照物(mimics NC、inhibitor NC)转染LX-2细胞,利用实时定量PCR检测miRNA-519d-3p在转染后LX-2细胞中的相对表达量,利用实时定量PCR和Western blot检测转染后LX-2中活化标志物α平滑肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)的mRNA和蛋白的表达水平,分析miR-519d-3p对LX-2细胞活化的影响;用流式细胞术检测转染后LX-2的凋亡率,分析miR-519d-3p对LX-2细胞凋亡的影响。结果miR-519d-3p mimics组与其阴性对照组相比,α-SMA和Collagen I mRNA与蛋白表达水平均降低(P均<0.01);miR-519d-3p inhibitor组与其阴性对照组相比,α-SMA和Collagen I mRNA及蛋白表达水平均增高(P均<0.01);流式细胞术结果表明,miR-519d-3p mimics组可以促进细胞凋亡(P<0.01);miR-519d-3p inhibitor组可以抑制细胞凋亡,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论miR-519d-3p具有抑制肝星状细胞活化,促进肝星状细胞凋亡,抑制肝纤维的作用。

^(99)Tc^(m)标记lncRNA HOTAIR反义寡核苷酸探针的制备及其对人脑胶质瘤U87细胞活性的影响

目的制备新型的靶向长链非编码RNA(lncRNA)同源异型盒基因转录的反义基因间RNA(HOTAIR)的反义寡核苷酸(ASON)探针^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON(HYNIC为联肼尼克酰胺),探讨其对人脑胶质瘤U87细胞增殖和迁移能力的影响。方法设计并通过化学修饰合成HOTAIR的ASON,使用双功能螯合剂HYNIC偶联^(99)Tc^(m)并进行纯化。采用快速薄层层析(ITLC)法和琼脂糖凝胶电泳分别检测探针的标记率、放射化学纯度、体外稳定性及完整性。细胞摄取实验分为2组:Lipo-^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON组(转染组)和^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON组(未转染组),通过脂质体转染探针,测定人脑胶质瘤U87细胞对探针的摄取率;细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验和细胞划痕实验分为3组:Lipo-^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON组(转染组)、^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON组(未转染组)、^(99)Tc^(m)-Control组(对照组),分别检测转染探针后细胞增殖和迁移能力的变化。2组间比较采用Student t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON的标记率为(90.0±5.6)%。琼脂糖凝胶电泳结果显示,^(99)Tc^(m)与探针成功标记并且没有明显的降解,探针孵育12 h的放射化学纯度>80%。细胞摄取实验结果显示,转染后5 h,探针Lipo-^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON在人脑胶质瘤U87细胞中的摄取率最大(0.70%),与未转染组(0.16%)相比,差异有统计学意义(t=17.81,P<0.01)。CCK-8实验结果显示,转染探针Lipo-^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON能抑制人脑胶质瘤U87细胞的增殖能力,与未转染组相比,在各个时间点(1、2、3、4、5 d)的差异均有统计学意义(t=2.336~30.230,均P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,转染探针Lipo-^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON能抑制人脑胶质瘤U87细胞的迁移,3组细胞间隙融合率的差异有统计学意义(F=331.8,P<0.01),与未转染组相比,转染组细胞间隙融合率明显降低,且差异有统计学意义(60.0%对23.6%,t=51.54,P<0.01)。结论成功合成了靶向人脑胶质瘤lncRNA HOTAIR的探针^(99)Tc^(m)-HYNIC-ASON,该探针具有良好的体外稳定性和靶向结合能力,能够抑制人脑胶质瘤U87细胞的增殖和迁移。