大肠杆菌(Escherichia coli)体外脂肪酸合成反应的重建

PCR扩增大肠杆菌参与脂肪酸合成的7个主要酶基因:fabD、fabG、fabH、fabA、fabZ、fabB和fabI,并构建相应的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中分别诱导表达酶蛋白,并使用Ni-NTA琼脂糖纯化到7种酶蛋白.体外添加所需酶蛋白和辅因子,在不使用[2-14C]丙二酸单酰CoA的条件下,成功地实现了脂肪酸合成反应的重建,另外还建立了数个鉴定有关酶蛋白功能的标准反应,并用其鉴定了丙酮丁醇梭菌FabZ的功能.

鸡白痢沙门菌的分离鉴定、耐药性及分子分型研究

为了解广东和广西两省鸡白痢沙门菌的耐药现状及其分子流行病学信息,对疑似鸡白痢沙门菌进行了病原菌分离鉴定.根据鸡白痢沙门菌invA基因进行PCR扩增鉴定,应用PFGE方法对菌株进行分型研究、采用纸片法检测菌株对18种抗菌药的药物敏感性.结果表明,分离到40株鸡白痢沙门菌;PFGE分型结果显示可分为22个不同型别,其相似值约为62％～100％,聚类分析和流行病学发现,广东和广西两省的11个不同地区间存在同源菌株,同个地区也有同源菌株;菌株对青霉素G、利福平、红霉素、等药物等常用药物高度耐药.临床治疗建议避免使用青霉素G、利福平和红霉素,应重视鸡白痢沙门菌的耐药情况;鸡白痢的流行与种鸡感染具有相关性,在防控该病时应加强种鸡的防疫措施.

基于微生物遗传技术与兽医学科结合的人才培养改革探索

加快农业科技创新,是实现现代农业的重大要素,是建设社会主义新农村的重大举措,是推进农村改革发展的重要任务,其中人才是关键.培养农业创新型人才有着重要的现实意义.本文从课程内容设计、授课形式等方面对微生物技术与兽医学科交叉结合教育进行探索,并提出微生物遗传技术与兽医学科结合课程建立需考虑的问题,以期为兽医创新人才培养提供参考.

不同源鼠伤寒沙门氏菌耐药性质粒不相容性分群的初步研究

试验利用PCR方法检测101株不同源鼠伤寒沙门氏菌携带质粒的不相容群,共设计18对引物,PCR分为5个三重PCR和3个单一PCR,用来检测识别FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FII复制子。101株不同源鼠伤寒沙门氏菌中94株(93.1%)携带质粒不相容群,共携带10种质粒不相容群,分别是Inc HI1、Inc HI2、Inc I1、Inc FIA、Inc FIB、Inc N、Inc Y、Inc P、Inc FIIA和Inc FrepB,其中76.6%的菌株携带2个或2个以上质粒不相容群。结合药物敏感性试验结果,追踪鼠伤寒沙门氏菌耐药传播机制。本研究调查了耐药性质粒在鼠伤寒沙门氏菌的水平传播特性,不同环境中大量的菌株介导特定多重耐药性质粒的扩散,对调查跟踪质粒赋予耐药的流行病学有重要意义。

galU和galE基因敲除对副猪嗜血杆菌脂寡糖分子质量的影响

副猪嗜血杆菌所引起的疾病每年给全世界养猪业造成巨大的经济损失,但是其毒力因子和致病机制仍不清楚。galU(编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶)和galE(编码UDP-半乳糖-4’-异构酶)是与多糖合成相关的2个基因,为了解它们的缺失对副猪嗜血杆菌脂寡糖分子质量的影响,利用热酚法抽提脂寡糖,经过SDS-PAGE和银染。结果显示,galU和galE的缺失导致脂寡糖的泳动速度明显加快,表明这两个基因与脂寡糖的分子质量密切相关。

冰鲜鸡生产链中沙门氏菌的分离鉴定及PFGE分型研究

为揭示冰鲜鸡生产链中沙门氏菌的分布及传播机制,本研究于2013年7月~2013年12月采集广东某大型一体化养鸡企业下属2个种鸡场、2个孵化场、2个肉鸡场、1个屠宰场和5个销售点样品,用常规法和PCR进行沙门氏菌的分离鉴定,并对分离出的沙门氏菌进行血清学鉴定和PFGE分子分型。种鸡场、肉鸡场、屠宰场和销售点的沙门氏菌的检出率分别为1.46%(7/480)、7.00%(21/300)、62.86%(22/35)和54.67%(41/75),孵化场雏鸡胎粪检出率为1.11%(2/180),死胚检出率为12.00%(9/75)。屠宰和销售环节是沙门氏菌污染的重要环节,食品安全风险较高。102株沙门氏菌共产生24种不同的PFGE谱型,从不同环节分离到多组相似度为100%的沙门氏菌,表明冰鲜鸡生产链中存在沙门氏菌沿生产链传播的现象。

副猪嗜血杆菌SC096株荚膜多糖抗猪肺泡巨噬细胞吞噬能力的研究

为探讨荚膜多糖在副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)抗猪肺泡巨噬细胞吞噬中的作用,作者用间接免疫荧光试验和流式细胞术对H.parasuis SC096分离株及其荚膜缺陷型菌株进行了抗巨噬细胞吞噬试验。间接免疫荧光试验显示野生菌株组的H.parasuis大多数存在于巨噬细胞外,而荚膜多糖缺失突变体则主要存在于巨噬细胞内。流式细胞仪检测结果表明,对应的野生型菌株组巨噬细胞总的吞噬率为12.51%,吞入效率为89.61%;而荚膜多糖缺陷型组巨噬细胞总的吞噬率为27.18%,吞入效率为91.06%。加入外源荚膜多糖后,野生型菌株组巨噬细胞总的吞噬率降为2.72%,吞入效率降为32.72%;荚膜多糖缺陷型组巨噬细胞总的吞噬率降为3.59%,吞入效率基本不变,为91.36%。荚膜多糖缺失后H.parasuis抗巨噬细胞吞噬能力降低,表明H.parasuis SC096株荚膜多糖具有抑制巨噬细胞吞噬能力的作用。

鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。

副猪嗜血杆菌15个血清型参考菌株acrA基因序列分析

acrA基因在细菌多重耐药中起重要作用。利用PCR扩增副猪嗜血杆菌15个血清型标准菌株acrA基因，应用ClustalW进行氨基酸进化距离分析和同源性分析，绘制进化树。序列测定与分析表明，aC—rA基因在副猪嗜血杆菌15个标准菌株中都存在，其中，血清5型、8型、14型有2个拷贝（acrA1和acrA2）。进化距离分析表明不同血清型之间AcrA1氨基酸序列有较大的差异，同源性为89．8％～100％。同一血清型副猪嗜血杆菌aerA1和acrA2氨基酸同源性低于30％，但都位于比较保守的基因座上，这是首次发现副猪嗜血杆菌会存在2个acrA基因。本研究为副猪嗜血杆菌多重耐药机制的研究提供了理论基础，同时对新型抗菌药物的研发也具有重要的参考价值。

HPS OmpP2膜外结构环诱导PAMs IL-8 mRNA转录的研究

OmpP2是副猪嗜血杆菌的致病因子,也是其重要的免疫原性蛋白。为探明OmpP2蛋白8个膜外结构环(Loop)在HPS感染过程中的促炎作用,本试验以猪肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophages,PAMs)为细胞模型,以HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白、HPS血清5型标准菌株全菌体及牛血清白蛋白(BSA)作为参照,通过Real-Time PCR的方法研究OmpP2 8个膜外结构环诱导PAMs产生炎性应答的作用。结果显示,与空白对照组相比,HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白膜外结构环均能诱导PAMs细胞使其促炎细胞因子IL-8的转录水平出现不同程度的上调,表明它们在HPS感染过程中参与了宿主肺泡巨噬细胞的促炎性免疫应答;在8个膜外结构环中,Loop7(2^(-△△Ct)≈8,P<0.05)表现出非常显著的刺激活性,远远高于其他膜外结构环组,并与HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白组的诱导上调幅度(2^(-△△Ct)≈12(P<0.05))最接近,表明Loop7在OmpP2蛋白诱导PAMsIL-8促炎性免疫应答过程中扮演着重要角色,结果暗示Loop7很可能是OmpP2致宿主肺巨噬细胞促炎性功能活跃区。本试验为进一步了解OmpP2蛋白功能及了解HPS诱导宿主细胞炎症反应分子机制提供实验基础。

鸡β干扰素的原核表达及抗病毒活性检测

根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中发表的鸡β干扰素基因序列进行密码子优化与人工合成,构建原核表达质粒pET-28b-ChIFN-β,重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,产物主要以包涵体形式存在。包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化后,SDS-PAGE、Western blot分析表明pET-28b-ChIFN-β表达正确,并且表达量较高。重组鸡β干扰素蛋白在DF-1细胞上能明显抑制水疱性口炎病毒繁殖,抗病毒活性达2.73×10-6UI/mg。本研究结果为鸡β干扰素在临床防治禽类病毒性疾病的探索奠定了基础。

高效赤红球菌协同CpG ODN增强鸡禽流感疫苗的免疫效力

禽类疫苗存在免疫效率低、免疫持续时间短和细胞免疫刺激不足等问题,新型禽类疫苗佐剂亟待开发。作者的前期研究证实,CpG ODN具有高度的安全性以及良好的细胞和体液免疫刺激功能,然而,CpG ODN的生产和使用成本十分高昂,尚未用于禽类疫苗佐剂。为了降低成本并提升功效,基于TLR2和TLR21潜在的协同关系,本研究以禽流感疫苗为模式疫苗,探究了赤红球菌和CpG ODN协同刺激免疫的关系。通过HI试验、细胞增殖试验和相关细胞因子表达量的检测,证实了该复合佐剂具有更强大的体液免疫和细胞免疫提升功效,能提升Th 1型免疫反应,免疫保护持续时间长,同时还能增强系统和局部免疫。通过检测受体的表达量,确证了CpG ODN与赤红球菌之间存在着协同关系。此外,在CpG ODN剂量减半的复合佐剂刺激试验中,发现由于协同关系的存在,CpG ODN半剂量的复合佐剂仍具有良好的免疫刺激效果。本研究为进一步降低CpG制剂的生产和使用成本做了先行探究,为CpG制剂高效且成本可控地应用于禽类动物养殖,乃至畜牧养殖奠定了基础。

广东省部分地区禽源弯曲杆菌流行病学调查及耐药性检测

为研究肉鸡生产链中弯曲杆菌的流行规律,从广东省广州市、佛山市的家禽养殖场、屠宰场和市场中采集了1 414份样本,通过分离细菌、检测耐药性及耐药基因等方法分析该病的流行规律。结果显示:共分离出201株弯曲杆菌,阳性率为14.21%,且养殖场(25.1%)到屠宰场(11.9%)到市场(7.1%)的弯曲杆菌污染率呈现递减趋势;弯曲杆菌分离株对喹诺酮类和磺胺类药物具有高耐药率且喹诺酮类药物耐药菌株的gyrA基因QRDR区域发生了C257T的突变,突变率为100%;大环内酯类药物耐药菌株的23 S rRNA基因均发生了A2075G点突变。此外,大环内酯类耐药株的甲基化酶耐药基因ermB的携带率为52.38%,四环素类药物耐药株的tet(O)基因的携带率为97.37%。研究表明广东省部分地区禽源弯曲杆菌对喹诺酮类耐药率高且多重耐药情况普遍,提示加强禽源弯曲杆菌耐药基因的监测。

广东省家禽弯曲菌流行病学调查及毒力基因分析

为了解近年来家禽弯曲杆菌的流行及变异特点,本研究从广东省的家禽养殖场、屠宰场及市场采集了1414份家禽样品进行弯曲杆菌的分离,比较了不同养殖场、不同周龄、屠宰场不同环节家禽弯曲杆菌的污染情况,并对部分分离株进行了15种毒力基因的检测。此次共分离到弯曲杆菌201株,阳性率为14.21%,表明广东地区鸡肉生产链中的弯曲杆菌具有较高的污染率,且随着鸡肉产品流向市场,阳性率有所降低;老旧养殖场弯曲杆菌污染率明显高于新建的养殖场;随着肉鸡年龄的增长弯曲杆菌的带菌率也随之提高;屠宰场中除了消毒环节,其他环节都存在弯曲杆菌污染,这说明弯曲杆菌的污染与环境、温度、母源抗体等因素有关。毒力基因检测结果表明:与侵袭有关的毒力基因htrA在空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的携带率均达到90%以上,且前者的毒力基因携带率高于后者;与侵袭、黏附、定植及编码细胞毒素有关的毒力基因,弯曲杆菌都高度携带,表明弯曲杆菌的毒力有增强的趋势。故加强家禽弯曲病的监测,对家禽养殖业和人类公共卫生安全具有重大意义。

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2的提取及鉴定

为简化副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白中的单一蛋白外膜蛋白P2(OmpP2)的分离步骤,降低膜蛋白分离的设备要求,本试验用Hps标准3型(SW114)、5型(Nagasaki)菌株作为试验材料,选用溶菌酶、核酸酶对Hps进行酶解以获得其完整外膜,然后利用含有2%tritonX-100缓冲液对外膜进行进一步解离,最后利用适量浓度的胰酶对强疏水蛋白进行酶解,实现了Hps高纯度OmpP2的体外快速提取。SDS-PAGE结果显示,上述2株菌OmpP2大小分别约为43和38ku;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定结果显示,从上述蛋白酶解下来的肽段经比对与Hps的OmpP2完全吻合。斑点杂交(Dot-blot)显示采自Hps患病猪血清在点有5型菌株(Nagasaki)OmpP2和点有3型菌株(SW114)OmpP2NC膜上均发生杂交显色反应,该结果暗示OmpP2是一个具有免疫活性的抗原。本研究为OmpP2功能及免疫保护性研究奠定了基础,也为副猪嗜血杆菌病免疫学诊断提供新的参考。

副猪嗜血杆菌脂酰辅酶A合成酶活性质谱定性分析

利用已纯化的FadD1和FadD2进行体外重构生化反应,通过质谱分析技术对2个脂酰辅酶A合成酶进行活性定性分析。体外酶活反应产物经UPLC-MS/MS质谱分析显示,全扫描模式,中性丢失扫描模式或多反应监测模式均显示酶活反应产物有脂酰辅酶A的生成,而且FadD1对脂酰辅酶A的转化效率要明显高于FadD2。质谱分析数据进一步确认脂酰辅酶A合成酶的生化功能,表明其在HPS存活过程中发挥着重要的生理功能,是其致病的关键蛋白之一。成功建立了脂酰辅酶A合成酶体外质谱分析方法,可为病原细菌相关基因功能研究提供技术基础。

副猪嗜血杆菌qseC基因缺失突变对生物被膜形成的影响

通过构建副猪嗜血杆菌qseC突变体,探讨qseC基因的缺失对副猪嗜血杆菌生长和生物被膜形成的影响。利用自然转化方法构建副猪嗜血杆菌qseC基因的突变体,测定副猪嗜血杆菌野生株SC096与缺失株ΔqseC的生长情况并绘制生长曲线。结晶紫染色法定性检测野生株和突变体生物被膜的差异;通过96微孔板定量方法检测突变体生物被膜的量;电镜观察二者生物被膜的变化。结果如下:成功构建qseC基因突变体。生长曲线显示副猪嗜血杆菌野生株SC096与缺失株ΔqseC生长速度基本一致。缺失株ΔqseC较之野生株SC096生物被膜的形成能力有所减弱。研究表明,qseC基因对副猪嗜血杆菌生物被膜的形成有重要的调控作用。