犊牛轮状病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

为能够现场快速检测出牛场牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV),本试验根据GenBank中BRV NSP5基因序列,针对其保守区域设计了一套RT-LAMP引物,通过对反应体系中Mg2+、dNTPs、内引物的用量以及反应时间和温度进行优化,建立一种能够快速检测BRV的反转录-环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法,并验证该方法的特异性、敏感性和重复性,选择出最优检测方法应用于后续临床样品的检验。结果表明:RT-LAMP方法的最佳反应温度为64℃、反应时间为45 min,Mg2+(100 mmol/L)和dNTPs(10 mmol/L)的最佳用量为1.2和1.5μL,内引物最佳用量为2μL;该方法从多种牛腹泻与呼吸道疾病的病原中只检测到BRV,其灵敏度为1×102 copies/μL,而普通RT-PCR的灵敏度为1×103 copies/μL,且重复性高;利用本试验建立的BRV RT-LAMP检测法和普通RT-PCR对38份临床样品进行检测,阳性率分别为47.4%和15.7%。综上所述,本试验建立的RT-LAMP检测方法具有检测速度快、特异性强、灵敏度高和可信度高等优点,且结果易于判定、便于现场检测,在BRV检测方面具有良好的应用前景,为BRV的流行病学调查及检测提供重要的技术支撑。