基于网络药理学探讨舒心口服液治疗冠心病心绞痛的作用机制

目的基于网络药理学探讨舒心口服液治疗冠心病心绞痛的作用机制。方法通过TCMSP、化源网、Pubchem、SwissTarget-Prediction等平台获取舒心口服液活性成分及对应靶点,借助GeneCards数据库获取冠心病心绞痛相关靶点,对药物靶点和疾病靶点取交集,获取交集靶点。使用Cytoscape软件,构建“药物-成分-靶点”网络图,利用STRING平台获取交集蛋白相互作用信息的TSV文件,使用Cytoscape绘制蛋白质相互作用(PPI)网络,MCODE插件进行蛋白聚类分析,利用DAVID数据库与微生信进行基因本体论功能富集分析(GO)和京都基因与基因组百科全书富集分析(KEGG)及绘图。结果筛选出舒心口服液55个活性成分,包括基质分解素-1(Stromelysin-1)、转录因子p65(Transcription factor p65)、M-乙酰胆碱受体M3(Muscarinic acetylcholine receptor M3);作用于冠心病心绞痛的潜在作用靶点有160个,包括JUN、AKT1、TP53、RELA、MAPK1、TNF等;KEGG分析得到167条相关通路,主要调节肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、磷脂酰肌醇-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、松弛素信号通路等发挥治疗冠心病心绞痛的作用。结论舒心口服液治疗冠心病心绞痛具有多靶点、多通路的特点,为舒心口服液治疗冠心病心绞痛的生物机制研究提供数据支撑,同时为进一步实验研究提供参考。

小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定

目的构建小鼠短发夹RNA(shRNA)-Schlafen3(Slfn3)重组腺病毒载体,并检测其在内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法采用GenBank基因软件查询小鼠Slfn3基因序列,设计并合成3个siRNA片段及其引物,取腺病毒干扰载体pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP,采用限制性内切酶进行酶切,线性化后连接siRNA片段,获得重组腺病毒载体shRNA-Slfn3,从中筛选阳性克隆抽提质粒,进行DNA测序验证;取对数生长期的人胚胎肾细胞HEK293,采用Admax系统将目的质粒转染至HEK293细胞,获得重组腺病毒shRNA-Slfn3后进行小量扩增及病毒滴度测定;取小鼠脾脏单个核细胞体外培养至对数期EPCs,用前述所得重组腺病毒shRNA-Slfn3对其进行转染48 h,采用绿色荧光蛋白量检测重组腺病毒的转染效率。结果测序验证3组目的质粒构建成功;获得shRNA-Slfn3重组腺病毒,病毒滴度分别为2.37×10^(13)pfu/L、3.16×10^(13)pfu/L及4.74×10^(13)pfu/L;EPCs转染效率为(63.64±2.58)%。结论成功构建了小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体,转染小鼠脾源EPCs后的转染效率较高。

基于网络药理学方法和分子对接技术探讨冠心苏合丸治疗冠心病的有效成分及作用机制

目的:基于网络药理学方法结合分子对接技术探讨冠心苏合丸(GXSHW)干预冠心病(coronary heart disease,CHD)的生物活性成分、关键靶点和潜在药理作用机制。方法:利用BATMAN-TCM数据库在线分析工具,获取GXSHW中每味中药的化合物成分和作用靶点,并进行筛选。通过GeneCards在线数据库获得CHD的相关靶点,利用Venny 2.1.0得到GXSHW与CHD的交集靶点。在STRING 11.5数据库中导入交集靶点并进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析,使用Cytoscape 3.9.1软件构建药物-成分-靶点网络,并通过拓扑分析筛选GXSHW治疗CHD排名前10位的核心靶点。之后通过DAVID在线数据库进行基因本体(GO)功能富集分析,包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)及KEGG通路富集分析,导出数据利用微生信在线软件作图展示。通过Autodock Tools 1.5.6软件对核心有效成分以及核心靶点进行分子对接验证。结果:从GXSHW筛选得到17个治疗CHD的核心成分,包括月桂酸、油酸、苏合香酯等;核心靶点有ADH1C、NR3C1、PIK3CA等。通过GO功能分析得到282个生物过程(BP)、62个细胞组分(CC)和68个分子功能(MF)。通过KEGG通路富集分析得到62条通路,其中糖尿病性心肌病、cGMP-PKG信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、心肌细胞的肾上腺素能信号传导、中性粒细胞胞外陷阱形成、白细胞经内皮细胞迁移、脂肪细胞中脂肪分解的调节、脂质和动脉粥样硬化、肾素分泌、破骨细胞分化、促性腺激素分泌、醛固酮调节的钠重吸收、钙信号通路、NF-κB信号通路等为GXSHW治疗CHD的核心通路。运用分子对接技术验证GXSHW中粉防己碱、油酸、α-枯烯、白桦脂酸与ADH1C、NR3C1、PIK3CA的结合能<-5.0 kcal/mol,对接效果好。结论:冠心苏合丸通过抑制血小板聚集、改善血管内皮功能、防止血栓形成、抑制血管平滑肌增殖、稳定粥样斑块等作用治疗冠心病。GXSHW中活性成分粉防己碱、油酸、α-枯烯、白桦脂酸、乙酸辛酯等作用于CHD的多个核心靶点,具有治疗CHD的重要价值。

基于网络药理学和分子对接技术探讨芪苈强心胶囊治疗冠心病的有效成分及作用机制

目的:基于网络药理学方法结合分子对接技术,探讨芪苈强心胶囊(Qili Qiangxin Capsules)干预冠心病(coronary heart disease,CHD)的潜在药理作用机制。方法:利用BATMAN-TCM在线分析工具数据库,获取芪苈强心胶囊中每味中药的化合物成分和靶点,通过GeneCards在线数据库获得CHD的作用靶点,利用Venny 2.1.0软件得到药物与疾病交集靶点。在STRING 11.5数据库中导入交集靶点并进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析,使用Cytoscape 3.9.1软件构建药物-成分-疾病网络,通过拓扑分析(degree≥中位数)筛选芪苈强心胶囊治疗CHD的靶点,通过DAVID在线数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,通过AutoDock Tools软件对核心有效成分以及靶点进行分子对接。结果:从芪苈强心胶囊中筛选得到24个治疗CHD的核心成分,包括十三烷酸、豆甾醇、月桂酸、花生四烯酸、十六烷酸、三磷酸腺苷、十五烷酸、1-十四醇、1-庚醇、腺嘌呤等;核心靶点包括ATP1A1、ADH1C、NR3C1、ESR1、AR、PGR、SCN5A、PRKAB1、KCNK4、GATM等;通过GO功能富集分析得到703个生物过程(BP),83个细胞组分(CC)和140个分子功能(MF)。通过KEGG通路富集分析得到通路166条,其中催乳素信号通路、补体和凝血级联、cAMP信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、肾素分泌、cGMP-PKG信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、钙信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号、内分泌抵抗、糖尿病心肌病、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路为芪苈强心胶囊治疗CHD的核心通路;豆甾醇、β-谷甾醇与ATP1A1对接的结合能分别为-10 kcal/mol、-9.5 kcal/mol,隐黄质与NR3C1、ADH1C对接的结合能分别为-9.6 kcal/mol、-9.0 kcal/mol。结论:芪苈强心胶囊通过抑制血小聚集、改善血管内皮功能、防止血栓形成、抑制血管平滑肌增殖、稳定粥样斑块等作用有效治疗冠心病。芪苈强心胶囊中活性成分豆甾醇、β-谷甾醇、隐黄质等具有很强的活性,作用于CHD的多个核心靶点,具有治疗CHD的潜在重要价值。

Slfn1通过下调Cyclin D1抑制内皮祖细胞的黏附功能

目的探讨睡眠因子1(Slfn1)对内皮祖细胞(EPC)黏附功能的影响。方法实验分为空白对照组(未给予任何处理的EPC,N-control组)、腺病毒阴性对照组(Ad-control组)、Slfn1腺病毒载体组(Ad-Slfn1组)、发夹状RNA阴性对照组(Sh RNA-control组)、发夹状RNA Slfn1干扰组(Sh RNA-Slfn1组)。分离培养大鼠骨髓源性EPC,用Sh RNA-control质粒、Ad-Slfn1及相应的对照质粒分别转染EPC,采用Western blot检测细胞Slfn1及Cyclin D1表达,将EPC接种在预先铺好纤维连接蛋白的培养板中,观察其黏附功能。用流式细胞仪检测细胞周期。结果Sh RNA-Slfn1组Slfn1蛋白的表达明显低于Sh RNA-control组,Ad-Slfn1组Slfn1蛋白的表达明显高于Ad-control组,说明转染有效。用Sh RNA-Slfn1减弱EPC Slfn1基因的表达明显增强EPC的黏附能力,过表达Slfn1基因则明显抑制EPC的黏附能力。细胞周期检查结果显示,降低EPC Slfn1基因的表达,EPC的细胞周期进入到S期细胞明显增多,过表达Slfn1基因使EPC的细胞周期停止在G1期。Western blot检测结果发现,Sh RNA-Slfn1组Cyclin D1的蛋白表达明显高于Sh RNA-control组,而Ad-Slfn1组Cyclin D1的蛋白表达则明显低于Ad-control组。结论 Slfn1通过下游靶点Cyclin D1负性调控EPC的黏附功能。

提高培养内皮祖细胞成功率的探讨

目的探讨培养大鼠内皮祖细胞的最佳适宜条件。方法通过密度梯度离心法分离培养来源于大鼠骨髓及脾脏的单核细胞,观察在不同条件下[pH值、二氧化碳(CO2)浓度、血清浓度、取材大鼠月龄、内皮祖细胞来源]培养内皮祖细胞的成功率。结果 pH 7.两组内皮祖细胞培养的成功率明显高于pH 7.4组(P<0.05),5.5%CO2浓度组内皮祖细胞培养的成功率明显高于5.0%CO2浓度组(P<0.05),1月龄组内皮祖细胞培养的成功率明显高于2月龄组(P<0.05),血清浓度及内皮组细胞来源对细胞培养的成功率无明显影响(P>0.05)。结论大鼠内皮祖细胞适宜在pH 7.2的DMEM-L培养液及培养箱CO2浓度为5.5%的环境下生长,且年幼的大鼠取材培养的成功率高。

瞬时受体电位1与心血管疾病关系研究进展

近年来，以高血压、冠心病等为主要疾病谱的心血管疾病，发病率、病死率呈逐年上升趋势。研究发现，经典瞬时受体电位（TRPC）在心血管疾病的发生、发展中扮演了重要的角色。TRPC通道是钙库操控性通道（SOCs）的成员之一，位于胞膜，并介导Ca2＋跨膜转运，影响细胞的增殖、迁移等基本生物学行为。

关节置换术后并发心肌梗死死亡三例报道并文献复习

老年退行性骨关节病及骨关节损伤严重影响患肢功能,最有效的治疗方法为人工关节置换术。虽然其技术成熟,但仍有少见的严重术后并发症发生。本文报道1例双膝关节退行性骨关节病、1例股骨粗隆间粉碎性骨折、1例股骨转子间陈旧性骨折经相应关节置换术后发生急性心肌梗死死亡的患者,并对已有文献进行复习。

大鼠Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG质粒的构建、基因结构分析及鉴定

目的:大鼠Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG基因重组表达质粒的构建及其基因结构分析。方法:通过UCSC(http://genome.ucsc.Edu/)分析大鼠瞬时受体电位通道4(TRPC4)及其家族基因组结构,并通过NCBI确定了TRPC4的蛋白结构域,通过Bio GPS(http://biogps.org/#goto=welcome)分析其表达模式;PCR扩增大鼠TRPC4蛋白编码区域(CDS),并通过限制性内切酶与穿梭载体pDOV-mCMV-MCS-EGFP-3FLAG进行连接,其产物转化细菌感受态细胞;挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序验证,测序正确的克隆即为目的质粒,命名为pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG;将该质粒转染HEK293细胞进行腺病毒包装,并命名为Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG,通过Western blot验证蛋白的表达。结果:生物学分析发现TRPC4蛋白保守的TRP-2、ANK及TRP结构域,通过Bio GPS分析发现TRPC4在杏仁核和海马中表达明显,在血管内皮细胞中也有表达;PCR克隆获得3 000 bp的TRPC4 CDS序列,CDS被亚克隆到表达载体pDOV-mCMVMCS-EGFP-3FLAG中,酶切鉴定及测序验证正确;进行腺病毒包装后的病毒可以在HEK293细胞中表达TRPC4-EGFP-3FLAG融合蛋白,Western blot证实其为含flag标签的蛋白且大小为128 KDa。结论:成功构建了大鼠TRPC4的腺病毒表达载体Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG。

新生儿与婴幼儿眼部菌群的调查

本文用分离培养法或聚合酶链反应（ＰＣＲ）检查了３６４例出生０—５岁的正常或患眼炎的新生儿及婴幼儿眼部菌群的种类、分布、来源、药物敏感性及其同眼炎的关系。结果表明新生儿出生２４小时内眼部大多无菌或仅可检出革兰氏阴性细菌，检出率为３３．３％；出生２天后可检出多种微生物，检出率达９４．２％；分离培养法检查的２２０例新生儿与婴幼儿中，眼部带菌者１９９例，感染率为９０．５％。共检出微生物２６２株，包括细菌２５５株，其中革兰氏阳性细菌１８７株，占７０．８％；革兰氏阴性细菌６８株，占２５．８％；真菌３株均为念珠菌，占１．１％；支原体２株均为脲原体，占０．８％；沙眼衣原体２株，占０．８％。ＰＣＲ法检查的１４４例新生儿中，沙眼衣原体阳性者２例，未检出脲原体。分离培养法检查的新生儿中，眼炎患者２２例，发病率为１０．０％。眼炎患者眼部检出的微生物均为细菌，包括葡萄球菌１７株，占６３．０％；肠道杆菌６株，占２２．２％；其他细菌４株，占１４．８％。新生儿或婴幼儿眼部检出的细菌对多种抗菌药物耐药，但对先锋霉素５和利福平的敏感性较高。真菌对制霉菌素的敏感性高于两性霉素Ｂ。认为新生儿眼部微生物的来源主要是出生后接触感染，这些微生物大多为暂?

无症状糖尿病患者左心房时相功能与心率变异性的相关性

目的采用组织多普勒超声心动图测量无症状糖尿病患者的左心房(LA)时相功能和心率变异性(HRV)指标,评价LA时相功能与HRV的相关性。方法选取158例血压正常且无临床症状的2型糖尿病患者(糖尿病组,n=158)与120例无心血管疾病血压正常健康者(对照组,n=120),采用组织多普勒超声心动图测量研究对象的LA总排空分数(LATEF)、LA被动排空分数(LAPEF)、LA主动排空分数(LAAEF)、左心室收缩期整体纵向应变(GLS)、LA长轴整体舒张早期峰值应变率及LA长轴整体舒张晚期峰值应变率。采用多功能心电图机测量研究对象的窦性心搏R-R间期(NN间期)的标准差(SDNN)、相邻R-R间期之差均方根值(rMSSD)、相邻的R-R间期之差大于50 ms的个数占总的R-R间期个数的百分比(p50NN)等时域HRV指标和低频功率(LF)、高频功率(HF)及总功率(TP)等频域HRV指标。比较糖尿病组与对照组以上指标的差异,采用单因素和多因素Logistic评价HRV指标与LATEF、GLS等LA时相功能指标的相关性。结果糖尿病组LATEF(t=5.167,P<0.001)、LAPEF(t=21.486,P<0.001)较对照组显著降低,LAAEF(t=8.467,P<0.001)较对照组显著提高。糖尿病组SDNN、rMSSD、p50NN、LF、HF和TP均较对照组显著降低(均P<0.001)。多因素Logistic回归分析表明,LATEF与HbA1c(OR=0.382,95%CI:0.239~0.633,P=0.007)、LVMI(OR=0.320,95%CI:0.195~0.608,P=0.003)和24h LF(OR=0.627,95%CI:1.486~3.812,P<0.001)独立相关。GLS与HbA1c(OR=0.547,95%CI:0.380~0.782,P=0.023)、LVMI(OR=0.982,95%CI:0.971~0.999,P=0.003)、E/e′(OR=0.344,95%CI:0.255~0.486,P=0.039)和24h LF(OR=6.611,95%CI:4.330~10.097,P<0.001)独立相关。结论无症状糖尿病患者的LA相位功能与自主神经功能显著受损。由容积和应变方法评估的LA存储功能、导管功能和辅泵功能受到糖尿病的显著影响。这些发现可以部分解释糖尿病患者心房颤动心血管发病率和死亡率的增加。

大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定

目的:建立一种可行的原代血管平滑肌细胞(VSMC)培养方法。方法:严格无菌操作环境下取大鼠胸主动脉及腹主动脉中层组织,通过组织块贴壁法进行原代培养,胰酶消化法进行传代,应用倒置相差显微镜对不同培养时间的细胞进行形态学观察,使用免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。结果:原代培养第4~6天时,组织块周围开始有长梭形细胞爬出;第7~9天时,细胞爬出较少的呈网状生长,组织块周围细胞爬出较多的呈漩涡状生长,致密排列呈束状;第10~14天时,细胞呈典型的"峰—谷"样结构,相互融合达80%,此时传代细胞生长速度增快,细胞变大,折光性减弱,免疫荧光染色鉴定可见VSMC特异性的α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)表达,表达的阳性细胞在95%以上。结论:成功建立一种可行的原代VSMC培养方法。

大鼠shRNA-Slfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠睡眠因子1(Slfn1)基因的发夹状RNA质粒,并进行腺病毒载体包装。方法:根据Rat slfn1基因的转录本设计并合成3个干扰RNA靶点ShRNA-Slfn1(1)、ShRNA-Slfn1(2)及ShRNA-Slfn1(3),并将单链的引物退火成双链oligo序列,连接入双酶切线性化的RNA干扰载体(p DKD-CMV-U6-shRNA)的U6启动子下游,替换掉原来的ccd B基因;利用Admax系统,将3种目的穿梭质粒分别与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒后进行小量扩增及病毒滴度测定;利用Slfn1过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签,通过Western Blot检测Slfn1过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag表达,观察靶点质粒对Slfn1表达的影响。结果:经菌落PCR鉴定获得阳性克隆并测序验证正确,表明构建质粒成功;腺病毒包装ShRNA-Slfn1(1)、ShRNA-Slfn1(2)及ShRNA-Slfn1(3)的病毒滴度分别为1.0×1014ifu/L,2.5×1014ifu/L,6.3×1013ifu/L,Western Blot证实ShRNA-Slfn1(1)及ShRNA-Slfn1(3)能显著降低转染293T细胞中Flag的表达,确定shRNA-Slfn1(1)及shRNA-Slfn1(3)为目的质粒。结论:成功构建了大鼠shRNA-slfn1的重组腺病毒载体。

大鼠骨髓源内皮祖细胞的分离与鉴定

目的:建立大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的分离与鉴定方法。方法:取大鼠双侧股骨和胫骨骨髓腔细胞,采用密度梯度离心法、组织淋巴细胞分离液分离单个核细胞,将细胞过滤离心后置于含20%FBS的DMEM低糖完全培养基中培养;采用流式细胞仪鉴定EPCs细胞表面标志物CD34、CD133及VEGFR2的表达。结果:细胞培养2 d后可观察到梭形的贴壁细胞,培养7 d后细胞呈克隆样集落,流式细胞仪鉴定为EPCs细胞的特征。结论:大鼠骨髓中可提取并分化出质量较好的EPCs细胞。

大鼠Slfn3基因重组腺病毒载体的构建和包装

目的:构建携带大鼠Slfn3基因的重组腺病毒表达载体,转染HEK293细胞产生病毒。方法:以p MSV-Slfn3-GFP为模板扩增Slfn3基因,再以质粒p Adeno-EF1a-MCS-MCMV-EGFP-3FLAG为载体,通过酶切、连接及转化获得p Adeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG重组腺病毒载体,采用内切酶Nhe I酶切及测序鉴定重组腺病毒载体,将该重组载体在HEK293细胞进行包装和放大培养,镜下观察荧光、Western blot鉴定重组质粒标签Flag蛋白在HEK293细胞中的表达。结果:构建重组腺病毒质粒p Adeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG,并在HEK293细胞中成功包装和扩增,经鉴定获得重组腺病毒r AD-Slfn3。结论:成功构建重组腺病毒载体p AdenoEF1-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG,并在HEK293细胞成功获得重组腺病毒r AD-Slfn3。

TAVI术后Ⅲ°AVB 1例

老年退行性心脏瓣膜病(senile degenerated heart valvular diseases,SDHVD)是心脏瓣膜随着年龄而发生钙化沉积性改变的病变。主动脉瓣关闭不全为常见并发症,主动脉瓣解剖主要包括主动脉根部(包括窦管交界、主动脉窦及功能主动脉瓣环)和主动脉瓣叶,二者构成类似圆柱体的功能复合体。

经典瞬时受体电位通道C亚族4在心血管系统疾病中的研究进展

经典瞬时受体电位通道C亚族4(TRPC4)是TRPC家族的一个亚型,包含6个跨膜结构域,11种剪接变体,是起源于细胞膜的一种非选择性阳离子通道蛋白,可在多个器官和细胞中表达,包括神经元的胞体和突触,心血管系统的内皮平滑肌细胞和心脏细胞,子宫肌瘤和骨骼肌细胞,肾和免疫细胞等。TRPC4通道的激活与心血管疾病的发生密切相关。本文主要对TRPC4的结构以及作用机制做简单阐述,总结TRPC4与高血压、扩张性心肌病、心肌梗死、血管新生、动脉粥样硬化等心血管系统疾病的相关性,以及其在心血管疾病中的作用的研究进展。

对1例34岁年轻女性发生急性心肌梗死的临床分析

急性心肌梗死(AMI)具有较高的致死率及致残率。AMI患者多为老年人。患有高血压、高血脂、糖尿病及吸烟等均是诱发AMI的高危因素。近年来,AMI患者的发病年龄越来越趋向于年轻化。本次研究主要是探讨对1例34岁AMI患者的病情进行诊断及治疗的经验。