3种气单胞菌耐药性及致病性的研究进展

气单胞菌广泛分布于水生生态系统中,不仅存在淡水流域的河流、沿海等地,还存在于自来水中,隶属革兰阴性菌,既可以感染鱼类,也可以感染人畜,是一种人-鱼-兽共患的条件性致病菌。本文着重以鱼类感染嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌所表现的临床症状为例,重点对这3种气单胞菌的形态特征及抗生素的耐药性、致病性进行讨论,以期为气单胞菌属的预防、治疗提供有利的参考和科学依据。

鲤鱼肺炎克雷伯氏菌分离与鉴定

初步了解肺炎克雷伯氏菌在鲤鱼鱼体中的发病机制并筛选防治药物,为预防和治疗该病提供准确实验数据。对发病鲤鱼进行细菌分离纯化,通过革兰氏染色反应,生理生化反应测定单菌落特性,进行细菌回归试验和药敏试验。对注射菌液后发病的鱼进行细菌再分离,得到革兰氏阴性菌,并且与七叶苷及其它17种指标反应呈阳性,与戊二酰-甘氨酸-精氨酸-AMC及其它11种指标反应呈阴性,注射该菌液48 h后鱼体出现与疑似病例相同病症。分离得到的细菌,按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定,确定为肺炎克雷伯氏菌。药敏试验结果表明该菌对亚胺培南等6种药物高度敏感。本试验首次从鲤鱼体内分离出肺炎克雷伯氏菌,并得到6种高度敏感的药物,同时阐明了肺炎克雷伯氏菌在鲤鱼中发病症状。

西藏野生双孢蘑菇驯化

对采自西藏自治区日喀则市高海拔地区的野生双孢蘑菇(Agaricus bisporus)进行驯化。结果表明:试验范围内,西藏野生双孢蘑菇的最适母种固体培养基配方为200.0g去皮马铃薯、20.0g葡萄糖、3.0g蛋白胨、1.0g KH_2PO_4、0.5g MgSO4、20.0g琼脂、1.0L水、pH自然,菌丝生长速度最快为0.21cm/d。最适原种培养基配方为93%麦粒、5%牛粪粉、1%石膏、1%石灰,原种的生长周期是28d。在栽培试验中,子实体的单位面积产量是8.71kg/m^2及平均单菇重47.56g,子实体颜色以浅褐色为主。

传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)分离株病原学研究及全基因组序列分析

为初步了解东北地区某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病病毒株的病原学特征,将该病毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染试验。结果显示,一周内人工感染试验鱼均出现明显的临床症状。将病死虹鳟鱼苗研磨过滤除菌后接种到胖头鱼肌肉细胞系(FHM),出现了特征性病变(CPE),用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)4组水生动物病毒的6对特异性引物对该毒株进行race-PCR,扩增其全长。结果显示,该病毒基因组全长为11 132 nt,基因组序列中4种核苷酸G、A、T、C含量分别为24.28%、28.67%、19.46%、27.59%。将序列与多株GenBank中已发表的IHNV毒株相应基因进行比较。结果显示,分离株G基因与韩国株ChYa07和PcKw11同源性较高,分别为97.8%和97.5%,其进化树分析结果显示,CJ-13株与韩国株和日本株在遗传进化关系上较近。

1株鲫源维氏气单胞菌的分离鉴定

为快速分离鉴定鲫鱼出血性败血症致病因子,从病死鲫鱼肝脏分离细菌,经LB固体培养基划线分离,28℃,24 h培养后,见圆润光滑、表面微凸的菌株呈优势生长,挑取单菌落命名为AX002。观察该菌在RYAN培养基28℃,24 h后生长成深绿色有深核菌落,同条件在RS培养基培养,24 h后长成黄色菌落,后逐步由内向外变为绿色菌落,通过全自动细菌鉴定系统,检测AX002对蔗糖等23种指标呈阳性反应,对山梨醇等22种指标呈阴性反应。设计引物扩增16S r DNA和促旋酶亚基(gyr B)基因并测序。测序结果与NCBI中其他菌株序列进行比对,建立系统发育树,确定AX002为维氏气单胞菌。同时该系统显示该菌对阿米卡星、头孢唑啉、复方新诺明、环丙沙星等15种抗生素敏感。该菌对头孢唑啉、氨苄西林和氨苄西林舒巴坦钠三中抗生素药物最低抑菌浓度>16μg/m L,对四环素最低抑菌浓度>8μg/m L,结果判定AX002对头孢唑啉、氨苄西林、氨苄西林舒巴坦钠和四环素具有耐药性。该菌对体长5~15 cm,体重30~50 g鲫鱼腹腔注射,测定半致死浓度(LD50)为2.38×107CFU/m L。本研究有利于进一步研究维氏气单胞菌。

鲫鱼戴氏西地西菌的分离与鉴定

本试验旨在从患病鲫鱼的鳃、肾、肝、胰脏等病灶部位分离病原菌,并对其进行鉴定。采用革兰染色的方法观察其为短杆状、呈单双排列的革兰阴性菌,利用美国BD公司生产的PhoenixTM100型全自动微生物分析仪进行生化鉴定及药敏试验分析,结果为戴氏西地西菌,对亚胺培南、美洛培南、左氧氟沙星和环丙沙星等高度敏感;对氨曲南和头孢唑啉耐药性最强。并绘制了此菌的生长曲线,发现2-6 h进入对数期,对数期时间较早,22 h后就进入了稳定期。后进行回归试验发现死亡率为66.7%,危害较大。因鱼类中发现戴氏西地西菌较少,所以本文对于鱼类戴氏西地西菌的研究有重要意义。

七彩鲑雌核发育及其倍性研究

利用紫外线照射对七彩鲑(Salvelinus fontinalis)精子进行灭活处理,使其遗传物质失活,作为同源精子诱导源,与七彩鲑卵子进行受精,采用冷休克方法诱导雌核发育。结果表明:同源精子可以诱导七彩鲑的雌核发育,紫外照射强度为72 m J/cm2;距离为8 cm;冷休克温度为20℃。七彩鲑减数分裂雌核发育倍性测定以鸡(Gallus sp.)红细胞DNA含量(2.5 pg/N)为标准、七彩鲑普通育苗子一代为参照,采用流式细胞术和微卫星标记技术对30尾七彩鲑减数分裂雌核发育鱼苗进行分析,证明了雌核发育鱼苗为雌核发育二倍体。

温和气单胞菌CRISPR位点的检测与分析

为检测3株温和气单胞菌中是否存在CRISPR,采用PCR方法扩增3株菌的CRISPR序列,并利用生物信息学方法分析和预测了重复序列(direct repeat,DR)的同源性及二级结构。结果显示,3株温和气单胞菌中可信CRISPR个数为1,总长度为2 805bp,并含有42条间隔序列;可疑CRISPR个数为3,总长度为384bp。对可信CRISPR的DR二级结构预测发现,可形成发夹环,且头环由15个碱基构成,茎环含有5个碱基。在CRISPR BLAST中对测序结果进行同源性比对时发现,除多数同属或同种外,DR与嗜热螺旋体DSM 6192菌株、暗网菌属等远缘菌种均具有较高的同源性,且置信值为1;这说明温和气单胞菌株的CRISPR序列存在水平基因转移,并可能存在其他的进化进程。

2株温和气单胞菌SNP位点比较分析

通过Illumina HiSeq 2500测序仪对2株温和气单胞菌A1、B2进行全基因组重测序,并与参考基因组(Aeromonas veronii B565,complete genome)序列进行比较,A1、B2与参考基因组之间共获得约100 018个SNP位点,与参考基因组平均比对率为74.46%。根据编码区SNPs分布与参考基因组间进行检测;通过COG和GO的功能注释,寻找A1、B2Diff基因的SNPs位点对2株温和气单胞菌进行注释分析,了解温和气单胞菌致病机制与基因组成,为今后温和气单胞菌的研究提供科学数据。

大麻哈鱼温和气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

为了解温和气单胞菌在大麻哈鱼中的发病症状并进行药敏试验,并为预防和治疗该病在大麻哈鱼中暴发提供试验数据,从患病大麻哈鱼鱼苗的鳃及内脏等病灶部位分离到1株细菌,经腹腔人工注射和人工浸浴感染试验均出现与自然病例相似的症状,并分离到革兰染色和生理生化特性结果与原菌株相同的细菌。结果表明,该菌为短杆状、两端钝圆的革兰阴性菌,与D-葡糖酸、丙二酸和葡萄糖等反应呈阳性,而与黏菌素、七叶苷和L-阿拉伯糖等反应呈阴性,结合16S r RNA基因序列分析结果,该菌与温和气单胞菌的亲缘关系最近,鉴定为温和气单胞菌。药敏试验结果显示,对氨苄西林、四环素和左氧氟沙星等药物表现出耐药,对阿米卡星和亚胺培南等药物敏感。本试验首次从大麻哈鱼体中分离出温和气单胞菌,并得到8种高度敏感的药物,同时阐明了温和气单胞菌在大麻哈鱼中的发病症状。

嗜水气单胞菌D102致弱菌株的制备和鉴定

为研究嗜水气单胞菌D102致弱菌株的制备、OD值变化及其致病性,首先利用细菌在生长过程中毒力不断减弱的特性,对嗜水气单胞菌102正常株进行数次传代培养,得到在血液琼脂平板上没有β-溶血圈的D102致弱株。然后对102正常株和D102致弱株进行OD值测定,发现102正常株在6 h时进入对数生长期,24 h开始进入稳定生长期;而D102致弱株在2 h即开始进入对数生长期,20 h时开始进入稳定生长,对数生长期较正常株提前。鱼体注射0.5 m L的D102致弱株菌液7 d后无发病现象,然后在不发病鱼体上注射强毒性102正常株原菌液。结果表明:80%的鱼正常生长,无发病状态,20%的鱼出现轻微充血后痊愈,D102致弱株对鲤鱼有很好的保护作用;提取不发病鱼的血清进行血清学反应,确定其抗体效价为1∶128。