人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析

外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）染色体上，获得遗传性稳定分泌表达株．利用酵母信号肽ＭＦα，对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计，使天然人ＴＰＯ成熟肽在毕赤酵母系统中分泌表达成功．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行分析，分子量约为６６ｋＤ处蛋白条带可被ＴＰＯ抗体识别；表达量约为０．１ｇ／Ｌ；Ｎ端氨基酸序列分析结果与设计的一致；表达产物对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（ｍｅｇａｋａｒｙ－ｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ－Ｍｅｇ）具有明显的刺激作用．

人PSP94全长cDNA的获得及PSP94-TNF~Δ融合蛋白的构建

利用ＲＴ－ＰＣＲ从人肥大前列腺组织钓取９４个氨基酸的人前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）全长ｃＤＮＡ，序列分析结果与文献报道的完全一致．将ＰＳＰ９４成熟肽与人ＴＮＦα衍生物（ＴＮＦΔ）通过Ｌｉｎｋｅｒ－ＳＡＰＧＴＰ在基因水平上融合成５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ，融合基因ＤＮＡ序列分析结果与设计的相符合．５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ在大肠杆菌中表达产物分子量约为３１ｋＤ，表达量约占菌体总蛋白量的３５％．以Ｌ９２９细胞和人前列腺癌细胞株ＰＣ－３为靶细胞进行细胞毒分析结果表明，５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ融合蛋白既具有ＴＮＦ的细胞毒活性。

SAPGTP和PG为接头的5'IL6-TNFα衍生物融合蛋白

通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白中对 Ｉ Ｌ６ 和 Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构的影响情况，从中选择了 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ接头．以 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ 作为接头的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和以 Ｐ Ｇ 为接头的５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构预测结果相似． Ｄ Ｎ Ａ 序列分析两种蛋白的接头序列均与设计的一致．５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ蛋白的大肠杆菌表达产物经初步分离、纯化及鉴定后，生物学活性及对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体肿瘤细胞的杀伤作用比较结果显示：在 Ｌ９２９细胞上，前者的生物学活性是后者的 ２７ 倍；在 Ｕ９３７ 细胞上，前者对肿瘤细胞的抑制率是后者的１３ 倍．它们对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体的 Ｕ９３７ 细胞杀伤作用分别是同样突变位点的人 Ｔ Ｎ Ｆα衍生物的３７ 和 ２９ 倍．实验表明， Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白优于以 Ｐ Ｇ 作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白．

新型人肿瘤坏死因子基因在血管内皮细胞中的靶向表达

目的探索一条肿瘤特异性基因治疗的新途径。方法将新型人 TNF- α D11a基因和 KDR特异性启动子插入到 3’L TR缺失 2 99bp的逆转录病毒载体 p L XSN中 ,构建成 p L XSN- D2 99- KDRp- TNF- α D11a重组逆转录病毒载体 ,使目的基因转录受 KDR启动子驱动。通过脂质体介导将该重组载体转染 PA317包装细胞 ,并用病毒上清感染血管内皮细胞和NIH3T3细胞。分别经 EL ISA和 MTT法测定 TNF- α D11a在血管内皮细胞中的表达及其生物学活性。结果成功构建了携带 TNF- α D11a和 KDR启动子的逆转录病毒载体 ,TNF- α D11a在血管内皮细胞中的表达水平及细胞增殖抑制作用均高于NIH3T3细胞。结论 KDR启动子可使外源 TNF-

rhTNFα D11a对S180肉瘤的体内抗肿瘤作用

ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ是利用基因工程技术制备的一种新型ＴＮＦ。体外在极低浓度下对多种人源性和鼠源性肿瘤细胞均有明显的细胞毒作用，与原型ｒｈＴＮＦα相比，其活性高１０倍以上；在小鼠和猴子体内进行的急性毒性和慢性毒性试验表明：其毒性比原型ｒｈＴＮＦα低约７倍。本文研究了ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤作用，结果表明：瘤内注射１×１０４Ｕ的ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ，７０％的动物肿瘤完全消失，其余动物肿瘤极显著减小，且发生组织重度坏死；注射１×１０３Ｕ，１０％的动物肿瘤完全消失，９０％的肿瘤不同程度地减小，肿瘤组织坏死程度以轻、中度为主；注射１×１０２Ｕ的动物肿瘤无明显减小，但生长率均显著低于对照组。

一种新型人TNFα对人肝癌裸鼠移植瘤的抗瘤作用

用人肝癌Ｂｅｌ７４０２瘤株建立了人肝癌裸鼠移植瘤模型，探讨新型重组人ＴＮＦα（ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ）对这种移植瘤的抗瘤作用。结果表明，ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ和原型重组人ＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）的抑瘤率在３０％左右时，后者所用的活性单位数是前者的２倍；两者用量相同时，前者的抑瘤率比后者提高２３个百分点。

PSP94-TNFαD11a质粒DNA注射体内表达规律

将带有目的基因PSP94 TNFαD11a的 pcDNA3 0质粒DNA ,以 5 0 μg/只剂量注射到 39只雄性昆明小鼠的股四头肌内 ,第 2、3、4、5、10、15、2 0、2 5天分别摘眼球取血收集血清 ,每组 3只动物血清混合。同时取注射部位骨骼肌 ,研磨后离心取上清。用ELSIA方法检测血清和骨骼肌上清中融合蛋白的表达 ,观察不同时间的蛋白表达水平。提取 14天骨骼肌组织的总RNA ,进行RT PCR分析目的基因mRNA的表达水平。结果 ,在裸质粒注射后 9天可检出目的蛋白的表达 ,第 14天出现表达高峰 ,观察至 2 5天仍可检察到蛋白表达。

人PSP94的分泌表达及其表达产物抗前列腺癌作用

将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9mg/L,分子量约 1 6.5k D.培养上清经离子交换层析纯化后 ,目的蛋白的纯度为 92 % .体外在人前列腺癌细胞上活性分析表明 ,rh PSP94以1 0 0μg/L ,对该细胞的抑制率 2 0 .4% ;单纯新型 TNF,以 1 0 3 U/ml,抑制率 2 9.8% ;rh PSP94和新型 TNF以上述同样剂量联合应用 ,抑制率为 86.3% .提示 PSP94在体外对抗前列腺癌细胞有杀伤作用 ,但不明显 ;PSP94与新型 TNF联合应用 ,可使抑制率明显提高 ,可能 PSP94与新型 TNF有协同抗前列腺癌的作用 .

血小板生成素糖基化与其体内生物学活性关系的研究

为探讨血小板生成素（ＴＰＯ）糖基化与其体内生物学活性的关系，给血小板缺乏症小鼠模型腹腔分别注射相同活性单位酵母系统表达的人ＴＰＯ成熟肽或大肠杆菌表达的人ＴＰＯＮ－端结构域蛋白，连续给药５ｄ，每天一次，末次给药后３ｄ，比较两种ＴＰＯ组动物外周血血小板数量、骨髓巨核细胞培养单位（ＣＦＵ－Ｍｅｇ）、骨髓有核细胞ＤＮＡ含量。结果高、中、低剂量的ＴＰＯ成熟肽组动物的血小板数、巨核细胞集落数和骨髓ＤＮＡ含量均明显高于ＴＰＯＮ－端结构域蛋白的相应组（Ｐ＜０．０１）。显示酵母系统表达的ＴＰＯ成熟肽比大肠杆菌表达的ＴＰＯＮ－端结构域有明显的生物学活性，这可能与它们的糖基化程度及半衰期有关。

大肠杆菌中表达的rhTNFαD11a的分离纯化

在大肠杆菌中表达的重组人ＴＮＦα衍生物（ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ）以可溶性形式存在，诱导后的菌体超声破碎后，依次经阶段盐析、离子交换层析及凝胶过滤，最终获得的ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ纯度达９９％。

PSP94抗血清制备及正常、增生和癌变前列腺人外周血PSP94分析

构建了GST PSP94融合蛋白表达质粒 pGEX PSP94,并使其在大肠杆菌中表达了GST PSP94融合蛋白。该融合蛋白经亲合层析纯化后 ,免疫家兔获得了PSP94抗血清。经Wensternblot分析 ,该PSP94抗血清可与重组PSP94蛋白发生特异性结合。用它对正常人和前列腺增生病人各 10例、前列腺癌病人 5例的外周血PSP94浓度进行了分析。结果显示 ,PSP94在这三种人外周血中的浓度无明显差异。提示PSP94不能作为前列腺癌的血清标志物。

人PSP94与TNFα衍生物联合治疗人前列腺癌的实验研究

构建了表达人 PSP94、TNFα衍生物 ( TNFα D1 1 a)及 PSP94与 TNFα D1 1 a( PSP94- TNFαD1 1 a)双功能蛋白真核表达质粒 pc DNA- TNFα D1 1 a、pc DNA- PSP94和 pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a,与 rh PSP94和 rh TNFα D1 1 a蛋白分别在人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型上进行了 PSP94与 TNFαD1 1 a联合治疗人前列腺癌的实验研究 .当动物肿瘤直径长至约 1 0 mm时 ,将以上 3种真核表达质粒分别以 50 μg/只的量给相应组动物的左右四头肌内注射一次 ,同时设 pc DNA3.0空载体对照组 ;rh PSP9450μg/kg、rh TNFαD1 1 a 1 0 0万单位 /kg、rh PSP94和 rh TNFαD1 1 a以同样剂量联合给药 ,肌肉注射 ,每 d一次 ,连续 1 0 d,同时设环磷酰胺阳性对照组和生理盐水阴性对照组 .基因治疗动物给药后第 1 5d处死 ,蛋白治疗组停药后第 2 d处死 ,观察疗效 ,计算抑瘤率 .结果显示 ,以上述方式给药 ,无论是基因治疗组还是重组蛋白组 ,给 PSP94的动物肿瘤虽然未见明显缩小 ,但肿瘤组织均出现不同程度的坏死和液化现象 ;给 TNFαD1 1 a的未见明显的抑瘤效果 ;PSP94-TNFαD1 1 a融合基因或 rh PSP94+ rh TNFαD1 1 a联合给药 ,不仅肿瘤有所缩小 ,而且也有不同程度的坏死和液化现象出现 .初步认为 :( 1 )

正常人前列腺组织PSP mRNA的表达

用ＲＴ－ＰＣＲ和ｃＤＮＡ序列测定法分析５名正常中国人前列腺组织中前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ）ｍＲＮＡ的表达。结果表明，在这５名正常前列腺组织中均同时存在ＰＳＰ９４和ＰＳＰ５７ｃＤＮＡ，且基因序列与文献报道的从前列腺癌和增生前列腺组织中获得的完全一致。这可能对ＰＳＰ进一步的基础研究和应用有一定的意义。

血小板生成素N端结构域及全长分子的生物学活性分析

以构建的人血小板生成素（ＴＰＯ）真核和原核表达质粒为基础，对其表达产物即ＴＰＯ全长分子及以融合蛋白形式表达的人ＴＰＯＮ端结构域，通过给Ｂａｂｌ／ｃ小鼠腹腔注射进行了生物活学性分析。结果表明，两种蛋白均具有明显促进血小板生成的作用。为进一步研究ＴＰＯ的糖基化与其生物学活性及半衰期关系打下基础。

酵母系统表达TPO与E.coli表达TPO N端结构域生物半衰期比较

为了探讨血小板生成素（ＴＰＯ）糖基化与其生物半衰期的关系，首先纯化了巴氏毕赤酵母系统分泌表达的人ＴＰＯ成熟肽和大肠杆菌表达的人ＴＰＯＮ端结构域蛋白．纯化产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定和活性分析后，两种蛋白以相同浓度或相同活性单位给Ｗｉｓｔｅｒ大鼠尾静脉注射，利用酶联免疫分析（ＥＬＩＳＡ）和ＴＦ１细胞测定不同时间点实验动物血浆中ＴＰＯ浓度或生物学活性，求出两种ＴＰＯ的生物半衰期（ｔ１／２）值．结果显示，以相同浓度和相同活性单位给药，ＴＰＯ成熟肽的ｔ１／２均比其Ｎ端结构域的长，前者分别是后者的１．６５倍和１．２７倍．

原位杂交检测增生和癌变前列腺组织中前列腺分泌蛋白94mRNA的表达

根据前列腺分泌蛋白 94(PSP94)和PSP5 7的基因结构特点 ,设计并合成了以地高辛标记的两条探针 ,利用组织原位杂交的方法 ,对增生和癌变前列腺组织中PSP94mRNA的表达量进行了比较。结果显示 ,2 0例增生前列腺组织 ,有 1 0例PSP94和PSP5 7共同探针的杂交信号比PSP94特异探针杂交信号强 ,1 0例相反。它们的共同点是均以腺体增生为主。而 7例前列腺癌组织中除 1例外 ,其余 6例PSP94特异探针的杂交信号均比PSP94和PSP5 7共同探针的杂交信号强。增生和癌变前列腺组织杂交结果比较 ,癌变前列腺组织PSP94特异探针杂交信号均比增生前列腺组织强。

PSP57不是增生和癌变前列腺组织PSP94 mRNA可变剪切特有的产物

目的 :比较人正常、增生和癌变前列腺组织中PSP94和PSP5 7mRNA的表达情况。方法 :提取事故死亡的正常成年人前列腺组织及手术得到的增生和前列腺癌组织总RNA ,进行RT PCR ,其产物分别以PSP94和PSP5 7共有的外显子及PSP94外显子Ⅲ作探针进行Southernblotting分析 ;RT PCR产物经克隆后进行序列测定。结果 :三种前列腺组织中均有PSP94和PSP5 7mRNA的表达 ;人正常前列腺组织中的PSP94及PSP5 7的基因序列与增生前列腺组织和癌变前列腺组织中的完全一致。结论 :PSP5

PSP94融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗前列腺癌活性分析

在从成年人正常前列腺组织中获得人９４ 个氨基酸的前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）ｃＤＮＡ 基础上，利用ＰＬ 表达系统，实现了人ＰＳＰ９４ 成熟肽Ｎ末端带有１９ 个外源氨基酸的融合蛋白在大肠杆菌中的表达。目的蛋白在细胞中主要以包涵体形式存在，表达量约占菌体总蛋白的３０ ％ ，分子量约为１６－５ｋＤ。表达产物在人前列腺癌细胞ＰＣ３ 上活性分析表明，该融合蛋白能明显抑制前列腺癌细胞的生长。

新型人TNFα对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用

本文研究了一种重组人ＴＮＦα衍生物（ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ）对小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌的抗肿瘤作用。同时与原型重组人ＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）的抗肿瘤作用进行了比较，并对它们全身给药和局部给药的抗瘤效果作了对比。Ｃ５７ＢＬ／６小鼠接种肿瘤细胞后ｄ７，将ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ和ｒｈＴＮＦα以高、中、低三种剂量分别连续肌肉注射４ｄ，或瘤内注射３ｄ，停药后１ｄ处死动物，根据抑瘤率进行疗效评价。结果表明，ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ各剂量组的抑瘤率均显著高于同样剂量的ｒｈＴＮＦα；两种ＴＮＦ瘤内注射的抗肿瘤作用均明显优于肌肉注射。

靶向表达TNFR75的逆转录病毒载体的构建及其产毒细胞系的建立

将编码人 TNFR75的 c RNA与血管内皮细胞特异性启动子 (KDRp)及缺失自身启动子的逆转录病毒载体 p LXSN- D2 99重组 .重组质粒 p LXSN- D2 99- KDRp- TNFR75与脂质体共转染包装细胞 PA31 7,经抗生素 G41 8(60 0 mg/L)筛选 1 4d,获得 1 5个稳定的产病毒细胞克隆 .将各细胞克隆分别扩大培养收集所产病毒上清 ,并感染 NIH3T3细胞检测病毒滴度 ,其中 1个克隆滴度达 2×1 0 5CFU/ml.提取该克隆细胞总 RNA进行 RT- PCR分析 ,获得的 c DNA片段长度与目的基因一致 .结果提示 ,建立了 TNFR75反转录病毒产毒细胞系 .