方法学验证-常见生化项目参考区间的确认

目的 对实验室现用生化指标总蛋白（TP）、总胆红素（TBIL）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、总胆固醇（TC）的生物参考区间进行验证,探讨是否适用于临床.方法 参照NCCLS C28-A2推荐方法,对健康参考个体240名采集符合本实验所需的血清标本.严格按照实验室SOP文件的操作规程在日立7600全自动生化分析仪上完成实验,利用SPSS软件对数据进行处理,对正态分布的数据资料其参考值范围由95%可信区间表示;对偏态分布的数据资料,采用百分位数法.试验所得参考值范围与现用参考区间的对比采用单样本T检验分析;分组处理数据则就其分布情况正态分布的采用两独立样本T检验;对两组数据为偏正态分布的采用两独立样本非参数检验.根据统计学结果,判断参考值范围.结果 在该实验室范围内,GLU,BUN和TC等项目的 现行参考区间保持一致,ALT,AST虽与现行参考区间保持一致,但应做性别分组处理;TP,TBIL的参考区间则与现行参考区间存在一定差异.结论 通过上述实验,对TP,TBIL,ALT,AST,GLU,BUN和TC等项目的 参考区间进行初步分析,对现行参考区间的设定提供建议与参考.

血管内皮生长因子受体KDR表达情况检测

目的 :检测血管内皮生长因子受体KDR在不同肿瘤细胞和组织中的表达情况。方法 :采用细胞酶联免疫和免疫组化法 ,利用抗KDR单克隆抗体 ,检测KDR在不同肿瘤细胞和组织表面的表达情况。结果 :发现KDR在人肝癌细胞SMMC 772 1和人胚胎脐静脉内皮细胞 (HUVEC)表面表达阳性 ,在人正常细胞Wish细胞和人平滑肌细胞表面表达呈阴性。在乳腺癌组织的血管内皮细胞表达阳性 ,而在乳腺炎和膀胱癌组织的血管内皮细胞表达呈阴性。结论 :KDR的特异性表达 ,可为肿瘤的靶向治疗提供一个很好的靶位点。

单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞中培养与增殖特性的研究

目的研究单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）在非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）中培养及增殖的合适条件。方法把HSV-2接种于Vero细胞中培养和传代,于不同时间收获病毒液并测毒力,进行不同培养条件的摸索。结果pH值、残留牛血清是HSV-2在Vero细胞培养的影响因素,最佳收毒时间为36-72h。在Vero细胞上培养病毒3-5代,病毒毒力较高。结论建立了单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞上培养增殖的初步方法,为下一步建立HSV-2的潜伏与激发细胞模型打下基础。

肺腺癌组织中表皮生长因子受体基因突变的检测及其临床意义

目的：通过检测肺腺癌组织中表皮生长因子受体（EGFR）基因的突变情况，研究EGFR突变与患者临床特征（性别、年龄和吸烟史）的相关性。方法：收集160例肺腺癌患者术前的石蜡组织标本，提取DNA后用实时定量PCR方法对EGFR基因18-21外显子进行突变检测；对基因突变结果与患者的性别、年龄和吸烟史分别做χ2检验。结果：160例肺腺癌组织标本中，有57例检测到EGFR基因突变，突变率为35.6%，且突变与患者性别、年龄和吸烟史均无显著相关性（P〈0.05）；57例EGFR基因突变标本中，27例为19外显子缺失，22例为21外显子L858R点突变，这2种突变占总突变类型的85.96%，并且与患者性别、年龄及吸烟史无显著相关性（P〈0.05）。结论：EGFR基因在女性不吸烟肺腺癌中有较高的突变率，突变主要集中在19外显子缺失和21外显子L858R点突变，但突变率及突变类型与患者性别、年龄和吸烟史均不相关。

茵陈提取物的纯化及体外抗肿瘤作用

目的 研究茵陈有效成分对BEL - 740 2人肝癌细胞株的体外抑制作用。方法 将茵陈的水提取物浓缩、干燥 ,经SephacrylS - 2 0 0分子筛过柱分离纯化其组分 ,以MTT法检测各成分对肿瘤细胞生长的影响。结果 经S - 2 0 0分子筛过柱分析发现茵陈具有含量和性质不同的 8个吸收峰。其颜色分别呈黄、白、褐和黑色 ,pH值在 5 8～ 6 2之间。除去第 1和第 6吸收峰外 ,其他吸收峰对BEL - 740 2细胞有不同程度抑制作用 ,第 2吸收峰浓度在 1 95μg/ml时抑制率为 37%。结论 茵陈至少含有 8种组分 ,其中 6种对BEL - 740

细胞角蛋白表达在甲状腺乳头状癌诊断中的应用

目的 探讨CK19、CK2 0在甲状腺乳头状癌中的表达及在诊断中的价值。方法 采用免疫组化SP法检测71例甲状腺病变中CK19、CK2 0蛋白的表达。结果 CK19在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率分别为 96 3% ( 2 6 /2 7,经典型 )和 83 3 % ( 5 /6 ,滤泡变异型 ) ,且多为强阳性表达 ;结节性甲状腺肿 ( 0 /2 3)和甲状腺腺瘤 ( 1/15 )基本不表达或仅弱阳性表达。与CK19相比 ,CK2 0在甲状腺乳头状癌中阳性率低且其阳性病例CK19也均阳性。结论 CK19阳性表达对甲状腺乳头状癌 ,特别是滤泡变异型具有辅助诊断作用 ,并对结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤有鉴别诊断作用。而CK2 0对甲状腺乳头状癌诊断价值则有限。

ELISA法检测单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性抗体的临床应用研究

目的探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV 2)感染的早期特异检测手段。方法对52例性病门诊的生殖器疱疹患者用改良的ELISA方法进行了HSV gD2IgG检测并同细胞分离方法进行对比观察。结果病毒分离的阳性率为69.2 % ,ELISA法检测抗体的阳性率为65 % ,两种方法检测结果差异无显著性。结论ELISA法检测血清疱疹病毒IgG抗体具有简便 ,快速 ,特异的优点 ,适合于临床大规模检测之用。

抗重组人血管生长素单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备不同类型抗重组人血管生长素（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｏｎ Ｈｕｍａｎ Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ ，ｒｈＡＮＧ） 的单克隆抗体，为进一步研究抗ｒｈＡＮＧ 抗体对ＡＮＧ 的中和作用以及对ＡＮＧ 依赖型肿瘤的抑瘤实验打下基础。方法：利用杂交瘤技术以ｒｈＡＮＧ 免疫Ｂａｌｂｃ小鼠，制备二株（Ｃ６ 、Ｃ４６） 能够稳定分泌抗ｒｈＡＮＧ 抗体的杂交瘤，并对上清进行ＥＬＩＳＡ、双扩散、免疫印迹等鉴定。结果：该抗体类别Ｃ６ 为ＩｇＧ１ ，Ｃ４６ 为ＩｇＭ，并特异地识别ｒｈＡＮＧ 与其它细胞因子及血清蛋白无交叉反应，免疫印迹显示该抗体与分子量１４４ｋＤｒｈＡＮＧ 蛋白结合，不与宿主菌体蛋白反应。结论：经多种方法鉴定获得的二株杂交瘤细胞分泌的抗体为ｒｈＡＮＧ 特异抗体。

BSP基因RNA干扰对乳腺癌MDA-MB-231BO细胞生物学特性的影响

旨在研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)基因表达后对人乳腺癌细胞MDA-MB-231BO生物学特性的影响。应用pSilencer5.1-U6Retro构建针对BSP基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒,将重组质粒转染293细胞制备病毒悬液感染MDA-MB-231BO细胞,利用嘌呤霉素筛选抑制BSP表达的乳腺癌细胞。Western blotting检测细胞内BSP蛋白表达,采用MTT法和集落形成试验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果显示,成功构建BSP基因RNAi稳定转染的231BO-BSP27细胞。231BO-BSP27细胞内BSP蛋白表达抑制率为69.3%,与对照组细胞相比,231BO-BSP27细胞的生长速率和克隆形成率明显降低;S期细胞数量明显减少,G0/G1期细胞增多。由此证实,逆转录病毒介导的RNAi能实现BSP基因稳定沉默,从而抑制MDA-MB-231BO细胞的生长和增殖。

抗重组人骨唾液酸蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价。结果获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rhBSP的杂交瘤细胞系AHB1和AHB5,Ig亚类分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型,其效价分别为1×10-3和1×10-7。腹水mAb经Protein A亲和色谱柱纯化后,纯度达92%以上。结论获得抗rhBSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能和用于临床诊断实验研究创造了条件。

9L/F344大鼠脑胶质瘤模型的建立

目的建立稳定的9L/F344大鼠脑胶质瘤模型。方法15只近交系雄性F344大鼠,采用立体定向技术,在大鼠右侧额叶尾状核接种1×105个9L细胞,观察大鼠生存状态;接种后第10、20天行MRI检查,观测颅内肿瘤生长情况。大鼠死亡后,取脑制作病理切片,行HE染色后观察肿瘤组织形态,采用免疫组织化学方法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白。结果大鼠接种肿瘤细胞后30d内全部死亡,平均生存时间(24.4±3.3)d。接种后10d,MRI增强扫描即可见肿瘤生成;接种后20d,MRI检查可见接种侧脑组织大片水肿,增强扫描肿瘤显像清晰。脑内均见肿瘤形成,未见肿瘤颅外生长;肿瘤周边界线较明显,但未见包膜;瘤内新生血管丰富,可见出血、坏死;肿瘤免疫组织化学GFAP和S-100蛋白染色阴性。结论该方法建立的大鼠脑胶质瘤模型稳定可靠,符合恶性胶质肉瘤生物学特性。该模型是理想的脑胶质瘤实验研究材料。

重组载体pEGFP-ANG的构建及ANG基因在HUVEC中的表达

目的 :建立血管生成素 (angiogenin ,ANG)基因的真核表达系统。方法 :采用化学合成拼接法 ,获得人ANG全长cDNA并测序 ,构建重组荧光真核细胞表达质粒 pEGFP ANG ,然后经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。应用荧光显微镜观测及免疫组化染色 ,对转染细胞内 pEGFP ANG的表达进行鉴定。结果 :测序表明 ,编码的氨基酸序列与人ANG完全一致。荧光显微镜下可见转染的HUVEC内发出强绿色荧光。免疫组化检测显示 ,转染的HUVEC中有棕色颗粒。结论 :获得了人ANG的全长编码基因。构建的重组体pEGFP ANG转染HUVEC后 。

双膦酸盐诱导骨巨细胞瘤细胞凋亡的实验研究

目的探讨双膦酸盐(唑来膦酸)对骨巨细胞瘤多核巨细胞和基质细胞的诱导凋亡作用。方法对我院收治的7例唑来膦酸治疗前后患者的肿瘤组织切片进行透射电镜观察和TUNEL凋亡染色及图像分析。另10例未予唑来膦酸治疗的患者,取术中切除的骨巨细胞瘤新鲜组织进行细胞原代培养,分别给予5、30、150μmol/L唑来膦酸诱导肿瘤细胞凋亡48h,倒置相差显微镜观察细胞形态,Annexin-V FITC凋亡染色及流式细胞仪定量分析。结果唑来膦酸治疗后的肿瘤组织切片透射电镜观察到多核巨细胞和基质细胞呈明显的凋亡表现;TUNEL染色呈强阳性;基质细胞凋亡率治疗前为1.31%,治疗后33.42%(P=0.018);多核巨细胞凋亡率治疗前为8.41%,治疗后56.83%(P=0.018)。在原代培养的骨巨细胞瘤基质细胞中予不同浓度的唑来膦酸诱导凋亡48h后,细胞数量减少,部分细胞形态有显著变化;Annexin-V FITC凋亡染色及流式细胞仪定量分析结果显示,对照组以及5、30、150μmol/L唑来膦酸诱导组的凋亡率分别为(10.67±2.15)%、(20.47±3.77)%、(44.21±8.34)%和(56.96±9.68)%,各诱导组显著高于对照组(P<0.05),且凋亡率呈剂量依赖性(r=0.775,P=0.000)。结论双膦酸盐能够诱导骨巨细胞瘤基质细胞和多核巨细胞的凋亡,且骨巨细胞瘤基质细胞的凋亡率呈剂量依赖性,因此,双膦酸盐可以作为骨巨细胞瘤辅助治疗的方法之一。

GFP为报告基因的酵母哺乳动物细胞穿梭载体的构建及其在人血管内皮细胞中的表达

为研究酵母作为载体在口服基因治疗及免疫中的作用 ,需要一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞中表达的穿梭载体 .利用通用载体质粒融合系统 (UPS)构建了一种以GFP为报告基因的新载体 ,以常规的氯化锂法对酿酒酵母进行转化 ,证明该载体能够在酵母中复制 ;以脂质体介导向人血管内皮细胞进行了转染 ,有绿色荧光 ,证明该载体能够在哺乳动物细胞中表达 .

木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化及其杀伤鼠肝癌细胞的作用

目的研究木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化工艺及其对鼠肝癌细胞hepa 6的杀伤作用。方法采用羧甲基纤维素离子交换色谱分离纯化木瓜凝乳蛋白酶 ,超滤浓缩后冷冻干燥。溴化四唑蓝 (MTT)法检测酶对鼠肝癌细胞的活性。结果分离纯化得到的木瓜凝乳蛋白酶比活为 5 5 4 2 .2IU/mg ,具有显著的抑瘤作用 ,呈浓度依赖性。结论该法分离纯化的木瓜凝乳蛋白酶比活高 ,体外杀伤鼠肝癌细胞作用显著。

厄贝沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导的人脐静脉内皮细胞产生组织因子的影响

目的:观察不同浓度的厄贝沙坦(Irbesartan)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)产生组织因子(TF)的影响。方法:胶原酶消化法分离HUVEC,采用改良后一期凝血法、酶联免疫吸附法(ELISA)和RT-PCR测各组细胞TF促凝血活性、含量和mRNA表达的变化。结果:①3种浓度的AngⅡ组HUVEC TF促凝血活性、含量和TF mRNA明显升高,与对照组相比,有显著性差异(P<0.05),AngⅡ的浓度越高,HUVEC TF促凝血活性和含量越明显;②3种浓度厄贝沙坦+AngⅡ组与对照组相比,TF促凝血活性和含量均显著降低(P<0.05),TF mRNA未见表达;HUVEC TF促凝血活性、含量和TF mRNA表达显著降低,与单独AngⅡ组相比,有显著性差异(P<0.05),且随着厄贝沙坦浓度的升高,HUVEC TF促凝血活性和含量进一步降低。结论:AngⅡ可诱导内皮细胞产生TF,影响内皮细胞抗血栓特性,厄贝沙坦通过抑制TF的产生,对保护血管内皮细胞,提高抗血栓功能有积极作用。

双膦酸盐对骨巨细胞瘤细胞超微结构的影响及细胞组织学变化

目的:探讨双膦酸盐对骨巨细胞瘤细胞超微结构的影响及细胞组织学变化。方法:取我院收治的7例双膦酸盐(唑来膦酸)治疗前后的患者肿瘤组织切片进行了透视电镜观察和TUNEL凋亡染色及图像分析。结果:双膦酸盐(唑来膦酸)治疗后的肿瘤组织切片中透视电镜下多核巨细胞和基质细胞出现了明显的凋亡表现,细胞质变化的特点是大量扩张紊乱的粗面内质网及分散于细胞质中包含于囊泡中央的高电子密度核。线粒体水肿或空泡化。巨细胞核变化的特点是形成致密的染色质材料分散于细胞核中,核膜增厚或分离,部分核碎裂和形成凋亡小体;双膦酸盐(唑来膦酸)治疗后的肿瘤组织切片中TUNEL染色强烈阳性,基质细胞凋亡率从治疗前的1.31%至治疗后的33.42%,差异有显著性意义(P=0.018),多核巨细胞凋亡率从治疗前的8.41%至治疗后的56.83%,差异有显著性意义(P=0.018)。结论:双膦酸盐可以诱导骨巨细胞瘤基质细胞和多核巨细胞的凋亡。从细胞和分子生物学水平证实双膦酸盐作为骨巨细胞瘤辅助治疗方法的可行性。

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子 (basicFibroblastGrowthFactor ,简称bFGF)的真核表达载体 ,以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用 .应用基因重组技术 ,将已经克隆的bFGF基因从PBR32 2_bFGF载体上亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1上 ,构建的重组质粒经脂质体介导转染 3T3细胞 ,36h后观察瞬时表达情况 .酶切 ,PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性 ;免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况 ,结果显示部分经转染的细胞呈阳性 (棕色颗粒 ) .结果表明已成功地构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1_bFGF ,并且bFGF能够在

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor ,bFGF)的荧光真核表达载体 ,以便进一步转染成骨细胞 ,研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术 ,将已经克隆的bFGF基因从PBR3 2 2 -bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP -C3 ,构建的重组质粒经脂质体介导转染 3T3细胞 ,3 6h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况 ,观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光 ;免疫组化检测bFGF的表达分泌情况 ,结果显示部分经转染的细胞呈阳性 (棕色颗粒 )。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP -C3 -bFGF ,并在 3T3细胞中表达了bFGF。

唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的可行性。方法取我院收治的7例唑来膦酸治疗前后的患者肿瘤组织切片行HE染色、茜素红染色、碱性磷酸酶(ALP)染色以及成骨前因子Ⅰ型胶原和骨唾液蛋白(BSP)的免疫组化染色。取10例未予唑来膦酸治疗的患者术中切除的骨巨细胞瘤新鲜组织进行原代培养,待骨巨细胞瘤基质细胞贴壁生长后分别给予1μmol/L唑来膦酸诱导12天后行ALP染色、免疫组化法检测Ⅰ型胶原和RT-PCR检测Cbfa-1的表达。结果 (1)唑来膦酸治疗前,肿瘤组织切片中骨巨细胞瘤基质细胞BSP染色阴性或低至中度阳性、Ⅰ型胶原染色阴性或轻度阳性,茜素红和ALP染色均为阴性;治疗后,茜素红染色阳性,ALP染色弱阳性,BSP和Ⅰ型胶原染色均转为强阳性,3例患者组织切片中HE染色发现类骨质或骨矿化的增加。(2)原代培养的骨巨细胞瘤基质细胞中予1μmol/L唑来膦酸诱导12天,空白对照组ALP和Ⅰ型胶原染色均为弱阳性表达,唑来膦酸诱导组呈阳性表达。RT-PCR检测发现唑来膦酸诱导组骨巨细胞癌基质细胞中Cbfa-1表达,而空白对照组未见Cbfa-1表达。结论体内外研究初步证实,骨巨细胞瘤基质细胞具有向成骨细胞分化的潜能并在唑来膦酸的诱导下向成骨细胞分化,这从细胞和分子生物学水平部分解释了临床上长期应用唑来膦酸治疗后肿瘤病灶和术后残留囊壁中的明显骨生成的现象。