纳豆激酶的分子生物学研究进展

综述了纳豆激酶的分子生物学研究进展。内容包括：纳豆激酶基因的核苷酸序列分析；纳豆激酶基因的克隆及表达；纳豆激酶的结构和功能；纳豆激酶的生产调控机制；纳豆激酶同其它枯草杆菌蛋白酶的同源性比较。

纳豆激酶基因在E.coli HB101中的初步表达研究

利用PCR技术以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因 ,将该基因克隆到温度诱导型表达载体pBV2 2 0上 ,转化E .coliHB1 0 1 ,获得转纳豆激酶基因重组菌。在确定了其最佳培养时间与诱导时间后 ,SDS PAGE分析结果表明基因表达产物为分泌型 ,蛋白表达量占菌体蛋白的 1 2 %左右 ,液体发酵后纳豆激酶产量可达 1 2 0U/mL菌液。对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究 ,结果表明该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性 ,而结构稳定性较差。

纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的纳豆杆菌基因组DNA中扩增纳豆激酶基因 ,将该基因克隆到表达载体PBV2 2 0上 ,筛选重组子 ,通过限制性内切酶和PCR技术分析 ,初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因 ,用凝块溶解时间法 (CLT)测出表达产物具有溶解血栓活性 ,证明该基因可在大肠杆菌中表达 .对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究 ,结果表明质粒的插入对宿主菌的生长没有太大影响 ,该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性 ,但结构稳定性较差 .SDS_PAGE分析结果表明基因表达产物为分泌型 ,蛋白表达量占菌体蛋白的 12 %左右 .

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用ＰＣＲ方法以分泌纳豆激酶的纳豆杆菌染色体ＤＮＡ为模板扩增纳豆激酶基因，将该基因克隆到质粒载体ＰＵＣ１９上，筛选重组子，通过限制性内切酶和ＰＣＲ技术分析初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因。利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达，凝块溶解时间法（ＣＬＴ）测出表达产物具有溶解血栓活性。在确定了最佳培养时间与诱导时间后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明基因表达产物为分泌型，蛋白表达量占菌体蛋白的１２％左右。

新型亲和技术在下游过程中的应用

基于生物分子之间特异性的亲和作用而发展起来的新的分离纯化与分析技术———膜亲和过滤、亲和萃取、亲和沉淀和亲和电泳在生物技术产品的分离纯化中显示出巨大的开发应用前景。本文综述有关的研究结果。

PCR扩增纳豆激酶基因的程序优化

研究了利用ＰＣＲ从纳豆菌基因组ＤＮＡ中扩增纳豆激酶基因的最优化条件，得到ＰＣＲ反应在本研究中的最重要的三个参数值为：模板量 １０ｎｇ； Ｍｇ２＋浓度豆．５ ｍｍｏｌ／Ｌ；退火温度６０℃．在这种优化程序下进行ＰＣＲ反应，获得了特异、高效和忠实的纳豆激酶基因产物．

反应介质对酶选择性的影响

有机相酶催化是酶工程研究最活跃的领域之一。本文主要综述了反应介质对酶底物选择性、酶对映体选择性、酶前手性选择性、酶区域选择性及酶基团选择性的影响。

产纳豆激酶之菌种的分离与培养

纳豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）是从日本传统食品纳豆中提取出来的一种具有溶血栓功能的酶．从市售纳豆中分离出一株能产ＮＫ的菌株，经鉴定为枯草芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，其液体培养生长曲线呈Ｓ形，６～４８ ｈ 为指数生长期，４８～９６ ｈ 为稳定生长期；产酶高峰期为稳定生长前期；大豆渣、豆浆、大豆蛋白胨及胰蛋白胨４ 种氮源中以大豆蛋白胨的产酶量最高，最高产酶量为６１０．７ 尿激酶单位／ｍ Ｌ 发酵液．