副溶血弧菌ompA基因缺失株的生物学特性及致病性分析

[目的]外膜蛋白Omp A是一个多功能蛋白,在很多革兰氏阴性菌的环境适应性和致病性过程中发挥重要作用,而副溶血弧菌Omp A的功能尚未见报道。本试验旨在研究omp A基因(VPA1186)对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建副溶血弧菌SH112株的omp A基因缺失株和互补株,开展对该基因在细菌生长特性、生物被膜形成、运动性、血清杀菌、细胞黏附、细胞毒性,组织载量以及小鼠致病性等相关生物学特性和致病性的影响研究。[结果]omp A的缺失不影响副溶血弧菌的生长速度、生物被膜形成能力和运动性。野生株和Δomp A的黏附和抗血清试验结果无显著差异。但Δomp A对Caco-2细胞的毒性作用显著低于野生株。小鼠染毒验结果显示,与感染野生株的小鼠相比,感染Δomp A的小鼠症状明显减轻,存活率更高,Δomp A在小鼠血液和肝脏中的带菌量显著低于野生株,而互补株的毒力恢复至野生株水平,表明omp A缺失能显著降低副溶血弧菌的毒力。[结论]omp A与副溶血弧菌的致病性相关,为潜在的毒力因子。

检测创伤弧菌两种毒力基因的环介导等温扩增检测方法的建立

为建立快速检测致病性创伤弧菌两种毒素的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,分别以创伤弧菌溶血素A基因(hemolysin gene A,HA)和多重毒素(repeats in toxin,RTX)毒力基因的保守序列作为靶序列设计内、外引物。通过肉眼观察白色沉淀初步判断检测结果,通过琼脂糖电泳最终确定检测结果。LAMP检测创伤弧菌的两种基因的灵敏度都达到10 CFU/mL。特异性结果表明致病性创伤弧菌的结果为阳性,而其他几种常见弧菌和食源菌检测结果为阴性。在人工模拟样品检测中,LAMP结果显示,采用水煮法提取DNA,从样品处理到报告结果耗时1.5 h,鱼肉中创伤弧菌的检出限为1×10~2 CFU/g(RTX)和1×10~4 CFU/g(HA);采用同样方法提取DNA进行普通PCR,其检出限为1×10~3 CFU/g(RTX)和1×10~4 CFU/g(HA),耗时4 h。结果表明,本研究建立的LAMP方法检测创伤弧菌两种毒力基因时具有灵敏度高、特异性强、方法简便等优点,适用于食品和养殖业中的现场快速检测。

弓形虫GRA1基因的原核表达与鉴定

为深入研究弓形虫致密颗粒蛋白GRA1及其单克隆抗体对弓形虫感染诊断的意义,本研究采用逆转录PCR方法扩增弓形虫RH株截短型GRA1基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS-PAGE分析表达情况,并分别通过Western blot和间接免疫荧光检测(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定蛋白和单抗的免疫原性。结果表明重组蛋白GRA1高效可溶性表达,分子量约为24 kDa,且在28℃条件下诱导表达效果更好。Western blot显示,重组蛋白GRA1可以被感染弓形虫的犬阳性血清识别,具有良好的反应原性。IFA显示单克隆抗体能够特异性地识别弓形虫的天然蛋白,GRA1主要分布于虫体的细胞质中。本研究结果可为利用GRA1蛋白和其单抗诊断弓形虫感染提供借鉴和依据。

面向边缘计算的属性加密方案

传统云环境下的属性加密方案在判定用户访问权限时通常仅依据年龄和职业等用户常规属性,而忽视了访问时间和位置的约束问题。为较好满足边缘计算的实时性和移动性需求,提出一种支持时间与位置约束的多授权外包属性加密方案。通过将时间域与位置域信息同时引入属性加密过程,实现更细粒度的访问控制。采用多授权机构共同管理属性信息,解决单授权机构的性能瓶颈问题,满足用户跨域访问需求。针对边缘计算中移动终端资源受限问题,将大部分解密计算外包至边缘节点,减轻移动终端设备负担。分析结果表明,在边缘计算环境下,该方案以较低的计算和存储开销实现了具有时间和位置约束的访问控制,并且可有效保障用户数据安全。

浅谈如何提高初中学生自主学习数学的能力

新的课程改革出台以后，改革提倡自主、探究与合作的学习方式。初中数学--作为令中学生们相对头疼的一门科目，自主学习定会让学生们束手无策。新课标指出：在教学条件下，所有的能有效地促进学生发展的学习，都一定是自主学习。实践证明在教学实践中可从创设情境，激发学生的学习动机；教给学生充足的认识策略；营造适合学生自主学习的空间；让学生及时总结经验，自我评价等方面培养学生的自主学习能力。作为教师要创造条件让学生充分参与学习活动，发挥学生自主能动性，使学生“能学”，要注意学生的学法指导，培养学生的自主获取知识的能力，使学生“会学”，还要促使学生成功，使学生“还想学”。只有这样，学生的自身素质才能得以提高，才能让学生获取主动的发展。

合作学习在高中英语教学中的运用分析

随着教学的不断革新，英语教学越发注重学生应用能力的提升，这就要求教学手段要实现创新，以求适应当前的教学要求。合作学习作为能够推动学生能力发展的有效途径，得到了越发广泛的应用。接下来，我将围绕合作学习，进行深入的探讨，就现阶段应用的问题给出几点切 实可行的策略。

浅议小学英语课堂教学氛围的重要性

小学英语是学生英语学习的初始阶段，营造良好的学习氛围，激发学生的英语学习兴趣，进行理论与实践相结合的素质教育，是目前小学英语教学的重要方向。本文先分析了小学英语课堂教学氛围的重要性及对教学效果的影响，然后提出了课堂教学氛围的营造方法。

情景对话在高中英语教学中的运用分析

英语教学中,情景对话教学是一种新颖的教学方式,旨在通过模拟英语对话中的情景,给学生呈现一个相对真实的学习情景,让学生学习正确的英语读音、单词用法以及语法规则,有效提高学生的学习兴趣。本文旨在探讨高中英语教学过程中,情景对话的运用分析。

浅谈如何培养中学生英语“自主学习能力”

目前中学英语教学中存在的主要问题是一部分教师仍沿袭“一言堂,一锅煮”的传统教育教学模式,将课堂当成“背堂”,将上课当成“演课”,将学生当成“容器”。整节课满堂灌,加上大量机械重复的练习以及频繁的考试,使教学缺乏活力,教学效果欠佳。

T3SS1和T3SS2影响副溶血弧菌生物学特性及细胞致病性的比较

【目的】探究两套Ⅲ型分泌系统T3SS1和T3SS2影响副溶血弧菌生物学特性及细胞致病性的差异和相关性。【方法】以T3SS1和T3SS2主要结构基因vcrD1和vcrD2为研究对象,利用同源重组技术分别构建单基因和双基因缺失株ΔvcrD1、ΔvcrD2、ΔvcrD1-vcrD2,以及互补株CΔvcrD1和CΔvcrD2;分析各菌株的生长特性、生物被膜形成能力、运动性的差异;比较各菌株对细胞毒性以及对细胞炎性因子转录水平的影响。【结果】与野生株相比,各缺失株的生长速度无显著差异。缺失株ΔvcrD1生物被膜形成能力、运动性和细胞毒性均极显著下降;缺失株ΔvcrD2主要表现为细胞炎性因子IL-1β和IL-6转录水平的显著上调,同时对细胞毒性作用下降。双基因缺失株ΔvcrD1-vcrD2在缺失株ΔvcrD1的基础上,生物被膜形成能力、运动性、细胞毒性均进一步显著下降,但在细胞炎性因子的转录水平上,则与ΔvcrD1一致,与野生株相比均无显著差异。【结论】T3SS1和T3SS2对副溶血弧菌生物学特性和细胞致病性的影响存在差异。T3SS1主要影响细菌的生物被膜形成、运动性及细胞毒性作用;T3SS2不影响生物被膜形成、运动性等生物学特性,参与细菌对细胞炎性反应中的负调控作用,同时具有一定的细胞毒性作用。T3SS1有助于副溶血弧菌在环境中的生存,而T3SS2可有利于细菌在宿主体内免疫逃避的过程。T3SS1和T3SS2对副溶血弧菌生物学特性和细胞致病性的影响可能存在一定的相关作用,具体机制有待进一步研究。

副溶血弧菌和霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与TaqMan探针。toxR和ompW探针5＇端分别标记FAM、CY5荧光报告基团,3＇端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示：该方法的副溶血弧菌和霍乱弧菌最低检测限均达到10 CFU/m L,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌（大肠杆菌O157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌）无交叉反应;批间和批内重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/m L和50 CFU/m L,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/m L和50 CFU/m L。两种细菌在虾肉中富集2 h后的最低检出限均为1 CFU/m L。结论：本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,包括DNA提取的整个检测过程可在1至3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。

副溶血弧菌极性鞭毛超微结构的电镜观察

为了观察副溶血弧菌从液体到固体表面的环境过渡中极性鞭毛的形态结构,选用副溶血弧菌的临床分离株SH112为研究对象,以副溶血弧菌ATCC33847为参考菌株,采用磷钨酸负染色法,通过高分辨透射电子显微镜观察细菌极性鞭毛的超微结构。结果显示:在这个过渡时期,副溶血弧菌的极性鞭毛有特殊的结构,包括不完整外鞘,"帽"状结构,以及长短和粗细变化等。推测这些结构的形成与环境的诱导以及鞭毛系统的调控机制有关。

采用IMS-RT-PCR方法快速检测肉制品中大肠杆菌O157

建立免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation,IMS）与实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-PCR）技术相结合快速检测肉制品中肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157的方法。利用改良热酚-水法提取EHEC O157的O-特异性多糖（O-specific polysaccharides,O-SP）作为筛选抗原,制备抗EHEC O157 O-SP单克隆抗体。将PM 3-50纳米磁珠经3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化后,与抗EHEC O157 O-SP单克隆抗体结合,得到偶联量为150μg/mg的免疫磁珠。免疫磁珠的最高捕获量为13748.33 CFU/0.2 mg,在肉制品中特异性捕获的最低检测限为2.2 CFU/m L。根据EHEC 0157血清型的特异性基因rfb E（Gen Bank登录号：S83460）设计引物和荧光探针,将IMS与RT-PCR相结合进行检测EHEC O157。当肉制品中EHEC O157含量≥1 CFU/g（2.5 g样本）,免疫磁珠能捕获,并通过EC肉汤培养基增殖3h后,RT-PCR即可成功检测,全程只需6-7 h。IMS-RT-PCR相结合的检测方法,在大大缩短了检测时间的基础上,再次降低了EHEC O157的检测限,在防范肉制品源性致病性EHEC O157传染方面具有重要意义。

家禽饲料中玉米赤霉烯酮化学发光酶联免疫分析方法的建立

为了建立比较间接竞争化学发光酶联免疫分析法（ic-CLEIA）与直接竞争化学发光酶联免疫分析法（dc-CLEIA）检测家禽饲料中玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）的方法,采用二因子交叉试验优化确定最佳包被原浓度和抗体稀释度,建立ic-CLEIA和dc-CLEIA。结果显示：icCLEIA在0.05-5 ng/m L范围内线性关系良好,线性回归方程为y=-0.383 5x＋0.417 9（R^2=0.994 6）,灵敏度（IC50）为0.611 ng/m L,检出限（LOD）为15 pg/m L,平均批内和批间变异系数为1.79%和1.02%,家禽饲料添加样品回收率为91.9%-112.1%,变异系数小于10.5%;dcCLEIA在0.025-5 ng/m L范围内线性关系良好,线性回归方程为y=-0.386 5x＋0.334 1（R^2=0.991 8）,灵敏度（IC50）为0.372 ng/m L,检出限（LOD）为3 pg/m L,平均批内和批间变异系数为1.16%和1.20%,添加样品回收率为87.3%-119.3%,变异系数小于9.8%。结果表明：两种方法精确,灵敏度高,均可作为定量检测ZEN的有效手段;与ic-CLEIA相比,dc-CLEIA更适用于检测家禽饲料中的ZEN。

副溶血弧菌主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快捷、准确、高效检测副溶血弧菌的方法,以副溶血弧菌种属特异性基因toxR和毒力因子tdh、trh基因序列,分别设计3对特异性引物及相应TaqMan探针,并在toxR、tdh和trh基因的3个探针的5'端分别标记FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端标记BHQ1淬灭荧光基团,通过优化反应体系和反应参数,确定最佳反应体系,建立一种基于Taq Man探针定量检测副溶血弧菌的三重荧光定量PCR方法。结果:本试验所建立三重荧光定量PCR方法与其他菌株无交叉反应,其最低检出限达到了10 CFU/m L,重复性试验中每组变异系数均小于1%;检测人工染菌的虾肉和贝类样品时,最低检出限亦达到10 CFU/m L,且整个检测扩增时间大约为1 h。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR检测方法,特异性强、敏感性高、重复性好且耗时短,是高通量检测致病性副溶血弧菌的有效手段。