6株嗜水气单胞菌的毒力因子及其对小鼠的致死性

根据嗜水气单胞菌毒素、蛋白酶及Ｓ蛋白３种毒力因子的检测结果，从６６株嗜水气单胞菌中选出３种毒力因子分布情况各异的有代表性的６个菌株。分别用含菌量均为１０８ＣＦＵ／ｍＬ的６株嗜水气单胞菌肉汤培养物注射小鼠，结果，毒素、蛋白酶及Ｓ蛋白均有的菌株以及具有前两者而无Ｓ蛋白的菌株对小鼠的致死率均达１００％；仅有蛋白酶的菌株对小鼠致死率达６０％；而只有Ｓ蛋白的，或既有毒素又有Ｓ蛋白的，或３种毒力因子均无的菌株对小鼠无致死性。

嗜水气单胞菌检验程序的研究

本试验系统研究了嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ，Ａｈ）的细菌学及毒力因子检测。对不同来源菌株的细菌作分离及生化鉴定，确定了Ａｈ的六项生化鉴定指标，同时比较确定了ＡＨＭ和ＲＳ作为Ａｈ的选择培养基。检验中氧化酶阳性反应是Ａｈ重要的鉴别指标。比较Ａｈ毒素、蛋白酶及Ｓ蛋白三种毒力因子的常规检测及免疫学检测，根据检测结果选出毒力因子分布各异的Ａｈ菌株作动物致死性试验，最终在Ａｈ三项毒力因子指标中选择蛋白酶一项作为检测指标，具有代表性，同时简化了检验程序，使Ａｈ的检测实际可行。

嗜水气单胞菌选择培养基鉴别效果的比较

本试验比较了嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ，Ａｈ）三种选择培养基ＡＨＭ、ＡＰＭ和ＲＳ培养基的鉴别效果，并用于１２１株细菌检测，Ａｈ的阳性检出率分别是５４．７６％、８１．３３％和８３．５４％。经过交叉比较分析，确定ＡＨＭ和ＲＳ可作为适用于生产实践的Ａｈ的选择培养基。

鸡脾转移因子对肉鸡免疫应答及防病效果的研究

以肉鸡脾为原料,采用超滤法制备鸡脾转移因子(Transfer factor,TF)。单独使用鸡脾TF以及与疫苗联合使用,比较不同剂量、不同使用时间对肉鸡平均日增重、死亡率、淋巴细胞比率、免疫器官指数、巨噬细胞吞噬指数的影响。结果显示,当鸡群处于健康状况时,使用鸡脾TF对试验结果影响不大,但当鸡群处于非健康状态时,使用鸡脾TF可以改善免疫应答指标,明显提高鸡群的抗病力和日增重。疫苗加TF组与单用疫苗组相比,差异不显著(P>0．05),但在降低死亡率和促进鸡增重以及提高巨噬细胞吞噬功能方面,疫苗组与对照组差异显著(P<0．05),疫苗加TF组与对照组差异极显著(P<0．01)。处于亚健康状态的鸡群使用鸡脾TF可提高机体抗病力,可与疫苗免疫同时使用,临床饮水使用的最佳剂量为0．5 mL／只。

鸡和猪脾转移因子活性组分的提取及免疫活性研究

采用Sephadex G-25柱层析法分离提取鸡、猪脾转移因子(Transfer Factor,TF)各组分。利用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型,通过MTT法比较鸡脾TF各组分及TF原液对免疫抑制小鼠和正常小鼠的淋巴细胞转化的作用,同时比较了不同来源的鸡脾和猪脾TF各组分及原液对正常小鼠淋巴细胞转化的作用。结果表明鸡脾和猪脾TF均由三大组分构成,其中鸡脾TF三大组分及原液均对免疫抑制小鼠的外周血淋巴细胞转化具有明显的免疫增强作用,与对照组相比均表现差异显著(P<0.01),其中组分Ⅲ的淋巴细胞转化最佳,组分Ⅰ与组分Ⅱ接近,但均优于原液。而对正常小鼠的外周血淋巴细胞转化却表现不同的结果,其中组分Ⅰ和原液具有显著的免疫增强作用(P<0.05),组分Ⅱ作用不显著,组分Ⅲ则起到极显著的抑制作用(P<0.01)。而不同来源的猪脾和鸡脾TF各组分及原液对正常小鼠的淋巴细胞均表现出一致的免疫活性。

嗜水气单胞菌铁载体的提纯及特性分析

提纯了嗜水气单胞菌（Ａｈ）Ｊ１ 株的铁载体（ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ） ，并对其特性进行了初步分析。Ａｈ Ｊ１ 株的培养上清液经聚酰胺柱层析、双蒸水洗脱、乙酸乙脂沉淀和真空冻干，获得白色粉末。用ＣＡＳ法及Ａｒｎｏｗ 法检测均为阳性，证实为铁载体，含有２ ，３二羟基苯甲酸（２ ，３ＤＨＢ） 功能团，属酚盐类铁载体。高压液相色谱分析表明，此种铁载体仅含甘氨酸、赖氨酸及色氨酸。上述纯化的铁载体，在体外培养条件下能促进产铁载体为弱阳性的Ａｈ Ｎ９ａ 株的生长，且能对抗ＥＤＤＡ 对细菌生长的抑制作用，显示铁载体能促进细菌的增殖，在细菌的感染致病过程中可能起重要作用。

兔副伤寒的诊断

本文报道了以怀孕母兔流产和新生仔兔死亡为特征的由鼠伤寒沙门氏菌引起的兔副伤寒的诊断．

鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株的选育

【目的】将鸭坦布苏病毒BZ_2010株在SPF鸡胚上进行连续传代致弱;旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以SPF鸡胚为增殖宿主,将BZ_2010株连续传代,直至第120代;以1日龄雏鸭和30周龄的产蛋种鸭为试验对象,对第120代次毒株(命名为VC2)的安全性进行评价;以1d雏鸭为试验对象,对VC2株的返强情况进行评价;以18周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的中和抗体进行监测;以25周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的保护效果进行评价;利用RT-PCR方法分别扩增BZ_2010株和VC2株的E基因和N54A基因,进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐缩短,而病毒毒价有逐)渐提高的趋势,ELD_(50)由第20代的10^(-5.3)/0.1 mL提高到第120代的10^(-5.8)/0.1mL,而且第80代之前提高较快,后期基本稳定。将VC2株通过颈部皮下接种1d雏鸭和肌肉接种30周龄产蛋种鸭,接种后试验鸭无异常临床表现,肝脏也无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的安全性。将VC2在1d雏鸭进行连续5次传代,未发现试验鸭有任何异常症状,将第5代组织悬液接种1d雏鸭,采集肝脏进行病理切片观察,发现无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的稳定性。基因测序分析结果显示,VC2株E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸发生改变,而NS4A蛋白只有一个氨基酸发生突变,即第54位氨基酸由F变为L。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,第4周即可达到高峰,并且维持较长时间;VC2免疫后于第2周和第50周利用强毒株进行攻毒试验,结果VC2免疫组在攻毒后未出现异常症状,粪便正常,产蛋率保持正常,这说明VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。【结论】通过鸡胚连续传代成功获得了一株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,可维持较长时间。攻毒试验结果表明,VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。

大肠埃希氏菌与败血霉形体引起鸡的呼吸道感染

大肠埃希氏菌经常使患传染性支气管炎、新城疫和霉形体病的病鸡发生呼吸道感染,这就是通常叫做‘气囊病’的疾病。病鸡经常出现继发性心包炎和肝周炎①。 1992年7～8月间,安顺地区某养殖场先后从外地引进明星商品肉鸡3500只、艾维因肉用种鸡2500只。在10。

铁对嗜水气单胞菌毒力因子的影响

用含不同浓度铁离子的培养基培养嗜水气单胞菌Ｊ－１株，３６ｈ时检测细菌含量以及毒素、蛋白酶、载铁体的表达量。发现菌液的浓度随着Ｆｅ２＋浓度的升高而升高，而毒力因子的表达量则相反，当Ｆｅ２＋的加入浓度为０时，毒素、蛋白酶、载铁体的表达量达最大值。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳及免疫转印分析细菌的外膜蛋白（ＯＭＰ），嗜水气单胞菌Ｊ－１株在表达载铁体的同时多表达一条ＯＭＰ，其相对分子质量为７１．７×１０３，应为载铁体的受体。此时，经ＥＬＩＳＡ检测细菌菌体及抽取物Ｓ蛋白为阴性；经超薄切片电镜观察，菌体无Ｓ层结构。随着铁离子浓度的降低，Ｊ－１株毒素、蛋白酶及载铁体的表达增多，菌体Ｓ蛋白消失，并产生相应的ＯＭＰ条带，显示铁对嗜水气单胞菌毒力因子的产生具有重要影响。

植酸酶对肉仔鸡生产性能、免疫功能及肠道微生物的影响

比较在营养水平相同的情况下,使用植酸酶日粮与普通日粮的鸡群在各阶段生产性能、淋巴细胞比率、免疫器官指数及盲肠内容物中大肠杆菌数量的变化。结果显示,添加植酸酶后,试验组较对照组平均日增重提高12%,其中雌性试验组与雌性对照组相比出栏体重增加396 g,平均日增重提高22.6%,差异极显著(P<0.01);植酸酶的使用能够有效降低盲肠大肠杆菌数量,雄性植酸酶组与雄性对照组相比在27,34,41日龄大肠杆菌数量降幅分别达到23%,34%和50%,而雌性植酸酶组与雌性对照组相比除34日龄外平均降幅达到50%。添加植酸酶后肉鸡巨噬细胞吞噬指数、免疫器官指数均出现不同程度下降。

新型抗菌肽CAMa的制备及其在断奶仔猪生产中的应用

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱密码子对设计的新型抗菌肽CAMa进行基因合成,将合成的CAMa基因克隆至载体pPICZαA上,构建穿梭载体pPICZαA-CAMa,电转化酵母菌X-33,经甲醇诱导表达,测定重组CAMa的抗菌活性,并通过断奶仔猪饲喂试验评价抗菌肽CAMa代替抗生素的效果。结果表明:新型抗菌肽CAMa在毕赤酵母X-33中获得分泌表达,并且对金黄色葡萄球菌CowanⅠ、大肠杆菌K12D31、猪大肠杆菌K88、猪大肠杆菌K99、猪大肠杆菌987P和猪沙门氏菌C782均有较好的抑杀活性。抗菌肽CAMa试验组和硫酸抗敌素对照组在仔猪增重、平均日增重、腹泻发生率上无显著差异(P>0.05),可作为抗生素类饲料添加剂替代品使用。

斑马鱼干扰素基因工程菌发酵条件及稳定性研究

采用液体传代的方法,研究表达斑马鱼干扰素(IFN)工程菌株pRSET-B-zIFN的遗传稳定性,并对其发酵工艺进行了优化。结果表明,构建的工程菌株遗传稳定性良好,在没有选择压力的情况下,传代100次质粒稳定性仍然保持100%,菌落形态及生长情况与原代菌无明显区别,SDS-PAGE结果显示zIFN表达量无明显差异。发酵条件研究表明,工程菌在LB培养基中,接种量为1%,诱导剂终浓度为0.1mmol/L,zIFN的表达量最高。

莱克多巴胺人工抗原及抗体的制备

莱克多巴胺是一种禁用β-兴奋剂,建立莱克多巴胺药残的快速检测方法是实现对其进行有力监控的有效途径,而莱克多巴胺抗体是快速免疫检测法的基本试剂。本实验用全新的方法研究了莱克多巴胺免疫原的合成,采用对氨基苯甲酸(ABA)和1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDE)将莱克多巴胺分别和cBSA、cOVA偶联,合成了莱克多巴胺的免疫原和包被抗原,并对其进行了紫外分析。用免疫原免疫新西兰大白兔,获得了高灵敏度和特异性的莱克多巴胺多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的IC50值为4.34ng/ml,所得多克隆抗体效价达到102400。

猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒的制备

为了制备猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒,根据GeneBank上公布的PCV2d亚型HB-MC1株的序列和大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2d亚型ORF2基因,克隆到原核表达载体pET30a(+),获得重组表达质粒pET30a-Cap2d,将该质粒转化入Rosetta(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析,利用Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验鉴定重组蛋白的免疫原性,并利用电镜技术鉴定重组Cap2d蛋白形成的病毒样颗粒。SDS-PAGE结果表明PCV2d的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达;电镜下观察超声破碎后的上清中存在大量直径约17 nm的病毒样颗粒;Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验结果表明该可溶性蛋白可与猪PCV2阳性血清特异性结合,具有较好的免疫原性。本研究为制备PCV2d亚单位疫苗和相关检测试剂盒奠定了基础。

特布他林人工抗原的合成和抗体的制备

特布他林是一种在食品中禁用的β-兴奋剂类药物,为建立针对β-兴奋剂的残留快速检测方法,作者研究了特布他林免疫原的合成和抗体的制备方法。采用1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDE)、对氨基苯甲酸(ABA)将特布他林(TER)分别与cBSA、cOVA偶联,合成了特布他林免疫原和包被抗原,并对其进行了紫外分析。用特布他林免疫原TER-cBSA免疫新西兰大白兔,获得了多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的性质,所得抗体效价达到51 200,IC50值为9.25ng/mL,证明了特布他林人工抗原偶联成功,所制备的特布他林抗体具有很高的灵敏度。

鸡γ-干扰素基因重组质粒在工程菌株中的稳定性研究

本文通过传代的方法研究了鸡γ-干扰素基因的重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌CH1中的遗传稳定性。结果表明重组质粒在没有筛选压力下存在质粒不稳定性,100代时质粒稳定性只有69%。适当的筛选压力可以显著降低质粒的遗传不稳定性,100代时稳定性提高到95%。各代重组菌株在生长性能、质粒酶切图谱、蛋白表达等方面均保持一致,未见明显差异。生物活性检测原代和100代均达到1.0×105IU/mL以上。以上结果表明重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌株CH1中具有良好的遗传稳定性,其质粒遗传不稳定性可由适当的筛选压力来控制。

简要概述狂犬病毒疫苗的研制进展

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患病，发病死亡率几乎100%，全世界每年有6万人死于狂犬病，我国是狂犬病流行较为严重的国家之一，目前尚无特效治疗药物，最有效的办法是用疫苗预防。1881年巴斯德首先发现了狂犬病病毒，并成功研制出了疫苗。狂犬疫苗按种类可分为灭活疫苗和减毒疫苗；按免疫对象可分为动物疫苗和人用疫苗，目前动物疫苗主要以减毒疫苗为主，人用疫苗主要是灭活疫苗；按病毒培养制备方式可分为组织培养疫苗、鸡胚疫苗和细胞疫苗，其中细胞疫苗又可分为原代细胞培养疫苗和传代细胞培养疫苗。狂犬病疫苗的研制及应用已有将近200多年，疫苗的生产制备方式不断更新。本文简要概述了狂犬病毒疫苗的研制进展。

混合菌固体发酵花生粕的工艺优化

本实验选用符合《饲料添加剂品种目录》的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)EM1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)JM、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BW2作为发酵菌株对花生粕进行固体发酵,以多肽和总酸含量为指标,通过单因素实验及正交试验对植物乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌接种量,发酵温度,发酵时间和料液比进行优化。确定工艺参数为:植物乳杆菌接种量5%,酿酒酵母接种量9%,枯草芽孢杆菌接种量9%,料液比1∶1.2,发酵温度37℃,发酵时间48 h。在此条件下发酵花生粕,多肽和总酸含量分别为18.89%±0.35%和9.12%±0.23%,较优化前分别提高33.78%和24.45%,提高幅度较大,可见优化后工艺稳定且重复性较好。