PK-15细胞的ISG15基因敲除促进PRV的复制

本试验旨在研究干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG 15基因敲除猪肾上皮(PK-15)细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG 15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP 0、PRV-gE、PRV-VP 16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG 15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG 15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG 15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG 15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG 15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG 15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。