多重数字PCR在rAAV基因组完整性评价中的探索应用

目的:探索采用多重数字PCR(dPCR)技术评价重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)基因组完整性的可行性。方法:采用芯片式dPCR系统,针对rAAV基因组的末端反向重复序列(ITR)区和目的基因(或3’非翻译区)建立双重PCR法,通过适量稀释使模板DNA在PCR芯片中呈理论单拷贝分布(阳性孔低于20%),单阳性孔代表非完整片段,双阳性孔代表2组引物对之间的序列完整,通过测试单、双阳性孔的比例,评价rAAV基因组的完整性;尝试采用不同样品前处理方式(病毒基因组DNA、病毒颗粒、DNaseⅠ处理),并比较测试结果。结果:双重PCR测得拷贝数与单重PCR基本一致,无明显干扰;在一定范围内,样本的实测拷贝数与模板量呈线性相关,但单阳、双阳比例基本一致;提取的病毒基因组DNA实测拷贝数减少,但双阳率高于未处理病毒样本,DNaseⅠ处理后的病毒样本实测拷贝数明显减少,单阳、双阳比例与未处理病毒样本基本一致。结论:多重dPCR技术可用于评价rAAV产品基因组完整性,具有良好的应用前景。

数字PCR技术检测rAAV产品中质粒DNA残留

目的:利用数字PCR(dPCR)技术检测重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)产品中质粒DNA残留。方法:针对质粒抗性基因KanR序列的4个不同区段设计引物探针,建立单重和双重dPCR检测KanR残留量;在双重dPCR中,双阳性孔代表2组引物对之间的序列完整,通过测试单、双阳性孔的比例,评价KanR序列的分布情况;利用DNaseⅠ消化游离的质粒DNA,评价病毒衣壳内错包装的质粒DNA情况。结果:4组单重dPCR实测KanR残留量之间基本一致(1.054×10^(8)~1.467×10^(8)copies·μL^(-1));双重dPCR与单重dPCR实测结果间无明显差异;双重dPCR在6~6 000 copies·μL^(-1)浓度范围内显示出良好的线性关系(r>0.999)和重复性(RSD<20%);1/2,2/3和3/43种组合的双重PCR的双阳性孔占比基本一致,表明KanR基因的断裂可能更趋向于随机断裂;DNaseⅠ处理前后结果提示,错包装的大片段质粒DNA(1/4双阳性)比游离的占比更高。结论:dPCR技术可用于检测rAAV产品中质粒DNA残留量,多重dPCR还可评估质粒DNA片段大小及分布情况。

mRNA药物研发的主要关键技术

基于mRNA的基因治疗药物及预防疫苗已成为开发热点,其技术原理是递送至机体细胞内的mRNA,通过宿主细胞的翻译机制表达产生治疗性蛋白或免疫原蛋白,对机体产生治疗作用或刺激机体产生免疫作用。mRNA药物研发的主要关键技术如体外合成、修饰、纯化以及递送等均具有较好的通用性。通过设计合成不同的目的基因序列,结合上述高度相似的下游关键技术,可实现不同目的蛋白的体内表达,使开发出基于mRNA的标准技术体系成为可能,从而针对疾病进行预防及治疗。高效低成本体外获取目的mRNA,修饰、处理使得mRNA具备高效翻译效率的同时降低机体免疫排斥,以及将外源性mRNA高效递送至体内,解决这些问题是mRNA药物研发的重点。本文主要综述了基于mRNA药物设计的主要关键技术,如mRNA体外转录合成(in vitro transcription,IVT)、核苷及帽尾结构修饰的技术原理及研究进展,其次对mRNA纯化方法、递送系统进行了简要介绍,为mRNA基因治疗药物及疫苗开发提供支持。