旋毛虫p53重组蛋白对血管内皮细胞通透性影响的研究

为研究旋毛虫p53蛋白对血管内皮细胞通透性影响的相关机制,本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVES)为细胞模型,通过体外实验利用不同浓度的旋毛虫p53重组蛋白(Ts-p53)刺激HUVES,采用CCK-8试剂盒筛选Ts-p53刺激HUVES细胞的最适浓度,通过Transwell小室方法检测内皮细胞通透性,利用荧光定量PCR(qPCR)检测细胞凋亡关键因子Bax、Bcl-2以及内皮细胞间连接蛋白Zo-1及VE-cadherin转录水平的变化,利用western blot方法检测细胞凋亡关键因子Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Pro-Caspase-9、cl-Caspase-9、Pro-Caspase-3、cl-Caspase-3以及内皮细胞间连接蛋白Zo-1及VE-cadherin蛋白表达量的变化。结果显示,Ts-p53刺激HUVES细胞的最适浓度为60μg/mL。随着Ts-p53对HUVES细胞作用时间的增加,FITC标记的白蛋白在感染3 h、6 h时内皮通透性Pa值逐渐上升,在12 h时尤为明显,并与空白对照组相比差异极显著(P<0.01),在刺激18 h时渗出指数下降。阳性对照组为LPS刺激HUVES,该组HUVES内皮通透性Pa值约为空白对照组HUVES的1.9倍(P<0.01)。表明Tsp53可以诱导HUVES通透性的增加。qPCR和western blot结果显示,与空白对照组相比,Ts-p53刺激3 h、6 h、12 h,Bax的转录水平和表达水平呈时间依赖性增加,在刺激12 h时其转录水平和表达水平最高(P<0.01),18 h时其转录水平和表达水平降低,阳性对照组Bax转录水平和表达水平极显著高于其他组(P<0.01)。与空白对照组比,Bcl-2的转录水平和表达水平呈时间依赖性减少,在刺激12 h时其转录水平和表达水平最低(P<0.01),18 h时其转录水平和表达水平均增加,阳性对照组Bcl-2转录水平和表达水平均低于其他组。在刺激12 h时,Bax/Bcl-2值最低。Western blot结果显示,与空白对照组相比,Cytochrome C表达水平也随着时间增加而增高,在12 h表达量最大,18 h表达量减少,阳性对照组该蛋白表达水平高于其他组,差异极显著(P<0.01)。随着刺激时间的增加,Caspase-3和Caspase-9蛋白被活化成cl-Caspase-3和cl-Caspase-9,均在12 h时变化最为显著(P<0.01),进一步验证了细胞凋亡的发生。与空白对照组相比细胞间连接蛋白ZO-1及VE-cadherin的转录水平和表达水平均呈时间依赖性减少,在12 h表达量最少(P<0.01)。综上所述,本研究首次证实Ts-p53可以通过引发细胞凋亡、破坏内皮细胞间连接蛋白两种方式破坏内皮细胞屏障,使血管内皮细胞通透性增加,该结果为旋毛虫感染发病机制的研究奠定了基础。

siRNA-881干扰GLS基因对旋毛虫肌幼虫抗酸能力的影响

为探究旋毛虫肌幼虫中是否存在谷氨酰胺依赖性抗酸机制(AR4),本研究根据GenBank中旋毛虫肌幼虫谷氨酰胺酶(TsGLS)基因序列设计3条特异性siRNA分子,并通过浸泡法分别导入旋毛虫肌幼虫体内,利用荧光定量PCR(qPCR)、western blot以及间接免疫荧光试验(IFA),筛选沉默效果最佳的siRNA分子,并确定其最佳转染条件,结果显示,siRNA-881为基因沉默最佳的siRNA分子,且转染12 h、2μmol/L浓度、培养3 d为最佳基因沉默条件。在不同的酸性条件下培养并检测转染siRNA后旋毛虫肌幼虫的存活率,进一步将转染siRNA-881的旋毛虫肌幼虫接种小鼠,分析TsGLS基因沉默对减虫率、保姆细胞壁厚度及子代肌幼虫基因转录水平的影响。转染siRNA-881后旋毛虫肌幼虫的存活率结果显示,在pH 2.5培养2 h时的存活率明显低于其他酸性环境下;转染siRNA-881的旋毛虫肌幼虫接种小鼠后7 d旋毛虫成虫减虫率和35 d旋毛虫肌幼虫减虫率分别为61.64%和66.71%;将保姆细胞壁厚度与PBS对照组比较,siRNA-881组(15.90±1.301)保姆细胞壁厚度降低了39.78%;siRNA-881转染旋毛虫肌幼虫后,子一代肌幼虫TsGLS基因的转录水平较亲代相比降低30.30%。以上结果表明,旋毛虫具有类似于大肠杆菌中存在的谷氨酰胺依赖性抗酸系统(AR4),抑制旋毛虫TsGLS基因表达可明显降低旋毛虫肌幼虫抗酸能力。本研究首次证实通过RNA干扰技术可有效抑制旋毛虫肌幼虫TsGLS基因的表达,使该虫的抗酸能力减弱,且在宿主肠道的定植能力下降,该结果为研究旋毛虫的致病机制及其感染的防治提供新思路。

旋毛虫HSP70蛋白诱导大鼠心肌细胞线粒体凋亡机制的研究

为了解旋毛虫HSP70致心肌损伤的机制,本研究将不同浓度旋毛虫重组HSP70蛋白(Ts-Hsp70)与大鼠心肌细胞H9c2共孵育后,采用CCK-8试剂盒筛选Ts-Hsp70作用H9c2细胞的最适浓度。以最适浓度Ts-Hsp70与H9c2细胞共孵育不同时间后,采用微孔板法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,采用比色法检测细胞培养上清液中心肌细胞损伤标志物肌酸激酶(CK)的含量,采用免疫荧光检测Ts-Hsp70作用后H9c2细胞活性氧(ROS)的释放,采用qPCR和western blot方法检测Ts-Hsp70作用后的H9c2细胞线粒体凋亡与抗凋亡途径中的Bax、Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome C与Bcl-2的基因转录水平与蛋白表达水平。结果显示,经最适浓度为60μg/mL的Ts-Hsp70分别刺激H9c2细胞6 h、12 h和18 h后,随着Ts-Hsp70对H9c2细胞作用时间的延长,LDH、CK、ROS含量与Bax、Cytochrome C及激活状态下的Caspase-3、Caspase-9基因转录水平与蛋白表达水均升高,且均于作用12 h时达峰值,显著高于对照组(P<0.01),而线粒体抗凋亡基因Bcl-2基因转录水平与蛋白表达水平随着Ts-Hsp70对H9c2细胞作用时间的延长均逐渐降低,且均于作用12 h时达谷值,显著低于对照组(P<0.01)。本研究首次证实Ts-Hsp70可增加细胞中LDH、CK、ROS的含量,激活并调节H9c2细胞中的线粒体凋亡通路,该研究结果为进一步研究旋毛虫致心肌损伤机制提供了基础数据。

哈尔滨市犬隐孢子虫流行病学调查研究

为了初步查明哈尔滨市犬隐孢子虫感染情况,试验对该市2018年1—12月份宠物医院、宠物市场和动物门诊3个不同地点随机采集的犬粪便样品2 000份进行调查,检查粪便样品中是否存在隐孢子虫卵囊并根据卵囊大小和形态进行虫种鉴定。根据鉴定结果利用Excel软件分别对不同调查点、不同年龄段和不同季节犬隐孢子虫感染情况进行分类整理。结果表明:所获卵囊为犬隐孢子虫卵囊,被检粪便样品中有430份查到犬隐孢子虫卵囊,其感染率为21.50%(430/2 000)。宠物医院、宠物市场和动物门诊的感染率分别为36.51%、17.33%和11.29%;小于4月龄、4~8月龄、8~12月龄和1岁以上犬的感染率分别为36.59%、24.14%、28.21%和10.99%;不同季节的感染率亦不同,其中春季24.05%,夏季28.82%,秋季16.98%,冬季11.62%。说明犬隐孢子虫的感染存在年龄和季节性差异,且饲养管理条件差时感染率高。

旋毛虫肌幼虫粗提物对成肌细胞增殖分化的影响

为探究旋毛虫肌幼虫粗提物(Trichinella spiralis muscle larvae crude worm extract,TMCWE)是否干扰旋毛虫寄生的骨骼肌修复过程及其影响保姆细胞形成的分子机制,以C2C12细胞系作为细胞模型,用不同质量浓度的TMCWE刺激C2C12细胞,并设空白对照组,分别于刺激后第0、3、6、12、24小时,通过检测C2C12细胞增殖分化相关因子及信号通路,在体外评估TMCWE对小鼠成肌细胞增殖与分化的影响。结果表明,TMCWE可促进Cyclin D1基因层面和蛋白层面的表达,能抑制分化标志物Myf5、Pax7和MYH及p21基因和蛋白表达水平;TMCWE可以促进AKT及NF-κB的磷酸化,激活PI3K/AKT/NF-κB信号通路。以上研究结果显示,TMCWE可通过上调PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关基因表达促进C2C12细胞增殖及下调分化标志分子基因的表达抑制C2C12细胞分化,这为阐明旋毛虫干扰骨骼肌修复和保姆细胞形成的分子机制提供理论依据和基础数据。